三种不同方法检测抗双链DNA抗体的比较分析

丁耀东，范雪丽，胡 彦，陈 华，谭立明，陈娟娟

(1、南昌大学公共卫生学院；2、南昌大学第一临床医学院；3、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

抗双链DNA(double stranded DNA，dsDNA)抗体是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的特异性抗体，其阳性率因检测方法及病情而异，在20%～90%之间，但其特异性极高，且有研究表明，抗dsDNA抗体直接参与SLE病人的肾脏损害[1]，因此有效的检测对SLE的临床诊断及治疗有

·论著·

三种不同方法检测抗双链DNA抗体的比较分析

丁耀东1，范雪丽2，胡 彦2，陈 华2，谭立明3，陈娟娟3

(1、南昌大学公共卫生学院；2、南昌大学第一临床医学院；3、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

目的比较三种不同方法检测抗双链DNA（dsDNA）抗体的敏感度、特异度和符合度，并探讨其与系统性红斑狼疮（SLE）活动情况的一致性，以指导临床工作。方法采用回顾性分析方法，对640例住院患者及健康体检者血清标本进行研究，其中215例SLE患者，用间接免疫荧光法（IIF）、线性印迹法（LIA）、放射免疫分析法(RIA)同时检测抗dsDNA抗体。结果抗dsDNA抗体用IIF、LIA和RIA法在SLE中的检出率分别为40.00%、43.72%、47.44%，与对照组有显著差异，三种方法特异性分别为98.35%、96.24%、94.59%，符合率分别为78.75%、78.59%、78.75%，具有极好的一致性（Kappa＞0.8）；三种方法在SLE活动期的检出率分别为60.76%、58.23%、60.76%，与SLE稳定期有显著差异，用RIA检测的抗dsDNA抗体的浓度与SLE活动性存在显著的线性趋势（P＜0.05）。结论抗dsDNA抗体不仅可以作为SLE患者的诊断标准还对其活动性的评估有着指导作用；三种方法学有着各自的优缺点，有条件的医院建议联合采用两种以上方法相互印证。

系统性红斑狼疮；双链DNA抗体；间接免疫荧光法；线性印迹法；放射免疫法

抗双链DNA(double stranded DNA，dsDNA)抗体是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的特异性抗体，其阳性率因检测方法及病情而异，在20%～90%之间，但其特异性极高，且有研究表明，抗dsDNA抗体直接参与SLE病人的肾脏损害[1]，因此有效的检测对SLE的临床诊断及治疗有

1 资料与方法

1.1 研究对象标本来源以南昌大学第二附属医院2012年1月-2015年5月间的381例住院患者，其中SLE患者215例，包括191例女性，24例男性，年龄为12～74岁；166例其他结缔组织病患者作为疾病对照组，包括55例混合性结缔组织病(MCTD)、6例干燥综合征(SS)、74例类风湿关节炎(RA)、12例系统性硬化症(SSc)、4例强直性脊柱炎(AS)和15例皮肌炎(DM)患者。259例健康体检者作为正常对照组。SLE诊断均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准[2]，SLE疾病活动程度的判断依据2000年修订的SLE疾病活动指数（SLEDAI-2000）进行评分：SLEDAI score<10分示SLE疾病稳定期指标，SLEDAI score≥10分示SLE疾病活动期指标[3]。

1.2 检测方法采集受试者肘静脉血，离心分离血清。待检血清抗dsDNA抗体同时使用间接免疫荧光法（IIF）、线性印迹法(LIA)、放射免疫分析（RIA）进行检测。IIF和LIA均采用欧蒙医学诊断公司的试剂，前者的抗原基质片上包被绿蝇短膜虫，并以异硫氰酸(FITC)标记的羊抗人IgG抗体为荧光二抗进行检测，后者采用的是抗核抗体谱检测试剂盒。RIA法采用北京北方生物技术研究所提供的抗ds-DNA抗体放射免疫分析试剂盒。操作步骤严格按各自说明书进行。

1.3 统计学分析采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析处理。正态分布的计量资料以均数表示，多样本均数的比较运用方差分析，偶然因素对观察一致性的影响进行Kappa分析，Kappa值越高一致性越好，<0.2一致性可忽略不计，0.2～0.4较差一致性，0.4～0.6中度一致性，0.6～0.8较好一致性，> 0.8以上极好一致性。计数资料以百分率的形式表示，采用卡方检验或Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗dsDNA抗体三种方法在各组中的检出率IIF法、LIA法、RIA法在SLE中的检出率分别为40.00%、43.72%、47.44%，均明显高于疾病对照组和健康体检组（P<0.01），见表1。

2.2 三种方法学检测抗dsDNA抗体对SLE的敏感性和特异性及一致性比较RIA敏感性最高，但特异性最低；IIF敏感性最低，特异性最高；LIA的敏感性和特异性在二者之间，三者有较好的符合率，见表2。

2.3 三种检测方法联合检测作平行实验IIF法与其他两种方法的相关性比较（表1，2），结果显示IIF法与其他两种方法检测比较差异无统计学意义（P> 0.05）。以IIF为固定组，分别与RIA、LIA比较，Kappa值分别为0.813、0.889，三者有着极好的一致性（表3）。

表1 三种方法在各组中抗双链DNA抗体的检出率

表2 三种方法检测抗ds-DNA抗体的敏感度和特异度及符合率

表3 IIF分别与RIF、LIF对检出结果的一致性比较

2.4 SLE稳定期与活动期及与其他结缔组织病抗dsDNA抗体阳性率的比较SLE活动期三种方法学检测抗dsDNA抗体的差异性较小，但在SLE稳定期较活动期差异更为显著，存在多例IIF检测抗dsDNA抗体阴性及部分LIA阴性而RIA阳性的标本(P<0.05)(表4)。在对照组内，三种方法下的dsDNA检出率略有差别。在类风湿关节炎、混合性结缔组织病，干燥综合征和体检者中用IIF检测到抗dsDNA抗体阳性率分别为0.00、5.45、0.00和0.02，LIF为0.00、7.27、16.67和0.04，而RIA结果分别为5.41、7.27、16.67和0.05。可见RIA的假阳性率高于其他两组（见表4），但三种方法检测抗dsDNA抗体在总的疾病对照组间差异没有统计学意义。

2.5 各组抗dsDNA抗体浓度与疾病活动度的关系比较及线性趋势检验RIA检测出健康及疾病对照组、SLE稳定组和SLE活动组的抗dsDNA抗体浓度总体均数及各组均数之间差异有统计学意义(F= 39.257，P＜0．05)。各组抗dsDNA抗体浓度均数的线性趋势检验结果显示(F=58.935，P＜0．05)各组抗ds-DNA抗体的浓度均数间呈线性趋势(P＜0.05)。见表5，图1。

表4 SLE稳定期与活动期及与其他结缔组织病抗dsDNA抗体阳性率的比较

表5 放射免疫分析法各组抗dsDNA抗体浓度均数比较及线性趋势检验

图1 对照组、SLE稳定组和SLE活动组抗dsDNA抗体浓度均数与疾病活动度关系图

3 讨论

系统性红斑狼疮是一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病，SLE的患病率因人群而异，全球平均患病率为12～39/10万，我国患病率为30.13～70.14/10万，以女性多见，尤其是20～40岁的育龄女性。由于SLE的发病机制至今未明，为其根治带来极大困难。在20世纪50年代SLE的5年存活率仅为20%，曾受到全世界各国医学专家的高度重视。经过60多年来的研究，除美国风湿病学会1982年修定的系统性红斑狼疮诊断标准为诊断SLE的主要标准外，SLE实验室诊断的应用显著地提高了SLE的检出率，改善了10年存活率。

系统性红斑狼疮患者血清中存在多种抗体，其抗dsDNA抗体是SLE患者血清存在的一种能与天然的脱氧核糖核酸（DNA）结合的成分。有研究证明抗dsDNA抗体参与SLE的病理过程，在疾病形成的过程中，dsDNA和其抗体形成的免疫复合物沉淀在皮下毛细血管、肾和其他器官内，激活补体系统，从而导致组织的损伤[4，5]；因其具有致病性，有效的治疗可使其滴度下降或转阴，是观察治疗效果的唯一抗体。因此，抗dsDNA抗体不仅有助于对SLE的诊断，还可以判断SLE的活动性及疗效的评价。本实验利用IIF、RIA和LIA对SLE组(包括SLE疾病稳定组和疾病活动组)及其他结缔组织疾病、健康对照组中抗dsDNA抗体检测分析，发现三种方法在SLE组的检出率明显高于疾病对照组和健康对照组，但其检出率低于王许娜等报道[6]，这可能与不同地区，不同种族及方法学的差异等因素造成的。在SLE组中的特异性都在94%以上，并且具有很高的符合率，此结果与已报道的文献相符[4，7，8]。此外，本研究表明在针对SLE疾病活动性检测时，三种方法在SLE患者疾病活动期，对抗dsDNA抗体检出率明显增高，分别为60.76%，58.23%，60.76%。RIA法检测出健康对照及疾病对照组、SLE稳定组和SLE活动组的抗dsDNA抗体浓度总体均数及各组均数之间比较差异有统计学意义(P＜0．05)，且SLE疾病活动度与抗dsDNA抗体的浓度呈线性趋势。这说明抗dsDNA抗体与SLE的疾病活动度密切相关，其抗体效价随疾病的活动或缓解而升降与文献一致[9，10]。因此测定血清抗dsDNA抗体对SLE活动度的识别、判定具有很高价值。

IIF法特异性较RIA法高，在检测抗dsDNA抗体时，因绿蝇短膜虫是一种血鞭毛虫，其动基体内含大量的纯dsDNA，不含ssDNA及其他细胞核抗原，抗原性比较特异，所以特异性较高[11]。但其敏感性较RIA低，RIA检测抗dsDNA抗体由于采用的是生物提取的dsDNA作为实验基质，在制备过程中，DNA的内部结构位点可能少部分人为暴露，从而会因抗ssDNA抗体的存在产生非特异性反应，因此假阳性比较多[12]，本研究结果证实了这一点。LIA的敏感性和特异性也较高，在二者之间，同时由于其易于判读结果，且对于不确定的荧光模型可以作为一个确认型的诊断有着重要的意义[13-15]，同时由于国内目前多采用IIF法和RIA检测，这些检测方法因操作过程复杂、人为影响因素多、需要特殊仪器并且RIA标记技术存在放射性污染、试剂盒有效期短等缺陷，限制了在基层单位的开展，LIA法操作方便，不需要特殊设备，适合基层医院及标本量较多的实验室进行筛查。同时结合RIA检测抗dsDNA抗体的浓度可以判断SLE的活动度和治疗效果，有利于指导临床治疗，因此，建议有条件的医院同时采用两种以上的检测方法，以便结果可以互相印证。

[1]Linnik MD，Hu JZ，Heilbrunn KR，et al.Relationship between antidouble-stranded DNA antibodies and exacerbation of renal disease in patients with systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum，2005，52(4)：1129-1137.

[2]杨静，刘志红.系统性红斑狼疮诊断标准的发展[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2013，22(2)：153-157.

[3]Gladman DD，Ibanez D，Urowitz MB.Systemic lupus erythematosus disease activity index 2000[J].J Rheumatol，2002，29(2)：288-291.

[4]Olson SW，Lee JJ，Prince LK，et al.Elevated subclinical double-Stranded DNA antibodies and future proliferative[J].Lupus Nephritis Clin J Am Soc Nephrol，2013，8(10)：1702-1708.

[5]Chin HJ，Ahn C，Lim CS，et al.Clinical implications ofantineutrophil cytoplasmic antibody test in lupus nephritis[J].Am J Nephrol，2000，20(1)：57-63．

[6]王许娜，尹光辉，孙晓旭，等.抗核小体抗体与抗dsDNA抗体在系统性红斑狼疮及狼疮肾炎诊断中的意义[J].中国现代医学杂志，2015，25(11)：97-100.

[7]黄银群，林秋强，陈绩才，等.抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗AnuA和抗rRNP抗体联合检测对系统性红斑狼疮的诊断价值[J].现代医院，2015，15(6)：32-35.

[8]万腊根，鞠北华，黄清水，等.SLE病人自身抗体检测的循证检验研究[J].实验与检验医学，2009，27(5)：441-444.

[9]Venner AA，Ibanez D，Gladman DD，et al.Comparison of three antidsDNA assays：Performance and correlation with systemic lupus erythematosus disease activity[J].Clin Biochem，2013，46(4-5)：317-320.

[10]黄勤，肖平，梁栋伟.联合测定抗ds-DNA抗体、超敏-CRP在评价系统性红斑狼疮活动性的意义[J].实验与检验医学，2010，28 (6)：569-570.

[11]秦雪，陶瑕，陈志坚，等.间接免疫荧光法与ELISA检测抗核抗体、抗双链DNA抗体的比对分析[J].南方医科大学学报，2009，29 (3)：472-475.

[12]谢永双，覃伟武，甘宁.放射免疫分析法测定抗双链DNA抗体在系统性红斑狼疮诊断中的应用[J].中国临床新医学，2009，2(8)：827-828.

[13]杨晓燕，陈涛，郭仲辉，等.线性免疫印迹法和酶联免疫吸附法检测抗核抗体的比较分析研究[J].中外医学研究，2014，12(23)：11-13.

[14]易萍.间接免疫荧光法与印迹法检测抗核抗体的相关性研究[J].中国实验诊断学，2015，19(6)：981-982.

[15]魏方.抗核抗体与抗ENA抗体的相关性分析[J].实验与检验医学，2009，27(1)：61-62.

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《实验与检验医学》编辑部

Comparative analysis of three different methods to detect anti-double-stranded DNA antibodies

DING Yaodong，CHEN Juanjuan，TAN Liming，et al.
School of Public Health，Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To analyze the sensitivity，specificity and coincidence rate of three methods for detecting anti-double stranded DNA(anti-dsDNA)antibody，and to explore the correlation of anti-dsDNA results and activity of systemic lupus erythematosus(SLE).Methods Anti-dsDNA antibody from 640 cases of inpatient and healthy controls，including 215 cases of SLE were measured by indirect immunofluorescence(IIF)，linear imprinting assay(LIA)and radioimmunoassay(RIA).Then the data were analyzed using retrospective method.Results The detectable rates of anti-dsDNA antibody in SLE by IIF，LIA and RIA were 40. 00%，43.72%and 47.44%respectively，with significant differences against the control group.The specificity of the three methods were 98.35%，96.24%and 94.59%respectively，in which the coincidence rates were 78.75%，78.59%and 78.75%respectively (kappa＞0.8).Of all the active SLE case diagnosed by the methods of IIF，LIA and RIA the detectable rates were 60.76%，58.23% and 60.76%respectively，which significantly differentiate stable SLE from active SLE.Moreover，the concentration of anti-dsDNA antibody by RIA and the activity of SLE were found to exist in an outstanding linear trend（P＜0.05）.Conclusion Anti-dsDNA antibody played an important role in the diagnosis and active evaluation of SLE，which suggested the combination usage of two or more methods if possible.

Systemic Lupus Erythematosus(SLE)；Double-stranded DNA antibody(dsDNA)；Indirect immunofluorescence method(IIF)；Linear imprinting assay(LIA)；Radioimmunoassay(RIA)重要意义。目前临床常用的检测方法有绿蝇短膜虫IIF、LIA、RIA、胶体金斑点法(DIGFA)及酶联免疫吸附法(ELISA)等，但不同检测方法的敏感度、特异度有所差异，临床应用各有利弊。本研究以IIF、LIA、RIA三种方法分别检测抗dsDNA抗体，对各种方法的敏感度、特异度及疾病活动期时的检出率进行对比分析，选出实用的检测方法，供临床参考。

R446.62

A

1674-1129(2015)06-0697-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.002

2015-10-16；

2015-11-21)

国家自然科学基金青年基金（81401964）；江西省青年科学基金（20142BAB215058）；江西省教育厅青年基金（GJJ14185）；南昌大学创新学分项目（14001849）。

丁耀东，女，1989年11月生，南昌大学公共卫生学院，2011级医学检验专业。

陈娟娟，女，1983年4月生，博士，主治医师，研究方向为临床免疫检验，肿瘤免疫。