一种低成本血液HIV病毒核酸筛查系统的开发和应用

钟展华，邹晓东，万小春，丁 渭，严凤好

(1、惠州市中心血站，广东惠州516000；2、中山大学达安基因股份有限公司，广东广州510665)

一种低成本血液HIV病毒核酸筛查系统的开发和应用

钟展华1，邹晓东1，万小春1，丁 渭2，严凤好1

(1、惠州市中心血站，广东惠州516000；2、中山大学达安基因股份有限公司，广东广州510665)

目的开发一种低成本，有效和方便快捷的血源筛查核酸检测系统。方法利用临床上使用的HIV-1核酸定量检测试剂，用酶免实验用的加样器对血液标本进行混样和核酸提取。结果使用常规方法和加样器改进方法的检测有效性没有差异，经过加样器改进的方法检测速度快，比常规手工方法劳动强度大大降低。结论低成本血液HIV病毒核酸筛查系统，成本低，效率高，可以有效提高血液的安全性。

低成本核酸检测；血液安全；PCR；HIV

核酸扩增技术(NAT)直接检测病毒核酸，因其可缩短病毒检测的窗口期而被应用于献血者筛查。西方发达国家1999年开始已经将NAT检测纳入献血者的常规筛查项目，输血感染传染病的危险性因而大大降低。我国近两年大力推进核酸检测，但核酸检测的成本很高，很多中小血站无法承受昂贵的检测费用。笔者所在血站与达安基因公司合作，将应用于临床的HIV PCR核酸定量试剂用于血液筛查，并利用现有的加样器对检测方法进行改进，提高了检测效率，降低了检测成本。现将有关内容报告如下。

1 材料与方法

1.1 检测标本2013年12月至2015年7月我站无偿献血的留样常规标本，使用5ml带分离胶EDTAK2真空采血管留样，1500r/min离心5min后2～8℃冰箱保存。

1.2 仪器7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；瑞士哈米尔顿STAR自动加样仪及其配套一次性加样针（瑞士HAMILTON公司）；单通道连续移液器（法国Gilson公司）；恒温金属浴（江苏金坛）。

1.3 试剂和耗材HIV核酸定量试剂盒（PCR-荧光探针法）（广州达安基因）、核酸提取试剂盒（离心柱法）、HIV-1 RNA标准物质（北京康彻斯坦生物，浓度为2000IU/ml，批号：201312001）、无水乙醇、经高压灭菌的一次性离心管和吸头、灭菌1.6ml深孔板等采购市售产品。

1.4 标准的核酸提取方法吸取每人份20μl血浆进行11人份混样，将混样的标本分配到已加入50μl蛋白酶K的1.5ml离心管内，按照试剂说明书进行核酸提取：加病毒裂解液→震荡→离心→温育→加无水乙醇→震荡→离心→转移到离心柱→离心→加入抑制物去除剂→离心→换收集管→加入去离子液→离心→换收集管→加入去离子液→离心→换收集管→离心→换离心管→烘干→加洗脱液→静置→离心→分配反应液→加样→盖八连管盖子→离心→上机。

1.5 改进的核酸提取方法

1.5.1 标本汇集和留样使用全自动加样器进行标本汇集，每人份吸取20μl血浆进行11人份混样，加入1.6ml深孔板里，混样前先在一个1.6ml深孔板每个标本留样400μl，用于一旦检测结果出现阳性后进行单个样品拆分检测。

1.5.2 病毒裂解使用全自动加样器每个孔分配50μl预先配置好的蛋白酶K和Carry RNA混合液后吹打8次进行混匀，加入200μl病毒裂解液，将深孔板盖上封板膜后，放入72℃水浴箱温浴10min。

1.5.3 过柱和洗柱将离心柱从收集管取出，套到普通10ml的纤维试管上，将已经加入无水乙醇的反应混合液分配到离心柱上。用普通的台式离心机将套有离心柱的纤维试管进行3000r/min 2min离心。分别进行过柱和洗柱，洗柱时，利用10ml连续加样枪分配抑制物去除液和去离子液。第二次将去离心水离心后，将离心柱装至新的收集管，将收集管-离心柱于室温下14000r/min离心3min以去除残余的乙醇。剩下的步骤按照试剂说明书操作，最后取得病毒核酸溶液。

1.5.4 加样利用STAR加样器和300μl带滤芯的加样尖，将反应液和待测核酸分配至8连管，8连管利用1.6ml深孔板进行位置固定。

1.6 检测的灵敏度及重复性测试以阴性血浆稀释HIV-1 RNA(2000IU/ml)标准品，配制成核酸拷贝数分别为1000、500、250、100、50、25IU/ml的HIV应用标准品溶液。于不同时间配制不同拷贝数的应用标准品溶液，进行重复核酸扩增检测，以观察扩增体系的稳定性，每个梯度共检测20份。

1.7 检测质量保证方法将内标溶液用洗脱液（DEPC水）稀释20倍，如内标结果是阴性，进行重复检测。如HIV结果为阳性，将原混合标本和单个标本均进行重复检测。

2 结果

2.1 不同检测体系的灵敏度及重复性比较标准的提取方法和改进后的提取方法以对不同拷贝数的标准品的检测情况见表1和表2，两者对≥100IU/ ml拷贝数HIV标准品的检出率均为95%，无显著差异。

2.2 献血标本检测情况献血者标本108194份，11人份混合后共检测出混合阳性49例，经过混合标本重复检测及拆分检测，最终CDC确认阳性48例。其中有一例第一次确认结果为不确定，10d后再次抽取的血样确认为阳性。

2.3 检测系统的有效性验证结果在检测过程中，不定时将浓度为2000IU/ml的的HIV RNA标准物质作为盲样随机插入已检测的阴性标本中，总共测试42例，均能成功检出。

表1 标准核酸提取方法的HIVRNA标准品检测灵敏度和重复性

表2 改进核酸提取方法的HIVRNA标准品检测灵敏度和重复性

3 讨论

国外有研究显示，处于HIV酶免窗口期的窗口期的血液具有高浓度病毒血症，HIV传播效率最高，56%~92%新的HIV感染是由处在这个时期的HIV感染者传播的[1]。近期发生在四川的因输血而感染HIV的事件证实了这一点，事后经过当地CDC的调查，确认为酶免窗口期感染，经过对留样的标本重新检测，第三代和第四代的酶免HIV诊断试剂依然均为阴性，但核酸检测显示是其病毒浓度高达37000IU/ml[2]。从前期已经开展核酸检测的血站，不断有报道检测出HIV窗口期的标本，如常州[3]、武汉[4]、辽宁[5]和济南[6]等，虽然2012版的《血站技术操作规程》和《全血和成分血质量要求》没有规定必须强制核酸检测，但国家卫生和计划生育委员会已将核酸检测作为血站2015年前必须完成的目标进行了规定[7]。因为我国的HIV感染率有上升的趋势，血液安全的形式不容乐观[8-15]。

但目前国内市场上获得我国食品和药品监督部门使用许可的核酸血液筛检试剂均含全套设备包括混样、核酸提取和荧光定量PCR仪均是进口的，成本较高。对于中小血站，如果没有获得政府财政的额外拨款，检测费用是个巨大的负担。国内很多生物技术企业，已经利用荧光PCR方法开发出成熟的NAT定量检测产品，主要用于传染病的诊断、病毒载量测定及抗病毒治疗效果评估，但这些产品只获得食品和药品监督部门临床诊断使用许可，而且操作繁琐和复杂。血站与医院的核酸检测相比，具有不同的特点，一是时间紧迫、当碰到急救用血的时候，检测结果不能拖延太长时间。二是血站的样本量一般都比较大。所以如果完全按照临床的方法进行检测，无论是时间还是成本均无法满足血站的实际工作要求。

本研究我们采取了几个措施来降低核酸检测的成本，一是只检测HIV、HBV和HCV暂时不检测，同时，HIV检测保留2遍ELISA方法。二是将标本进行混样后再检测，为了跟酶免检测衔接和拆分方便，混样的数量我们确定为11个，因为一个酶标检测微板，有96孔，12竖排，在混样前，先用1.6ml深孔板留样，第一竖排作为一旦出现阳性时的备查标本，其他11横排的留样标本作为出现阳性后，进行单个标本拆分检测。三是将标本混样的工作交由进行ELISA实验的加样器来完成。四是核酸提取的方法磁珠法改为离心柱法，将核酸提取由核酸提取仪改为手工提取，同时，为了提高检测效率，利用加样器对实验方法进行改进。经过以上措施，可以将核酸检测的成本降低为血筛试剂的10%左右，相当于加做一遍HIV的酶免实验的费用。

虽然用以上方法将核酸检测的成本大大降低，但从以上数据表明，我们的检测方法是有效和适合在血站应用的。首先是内对照的稀释和成功检出，有研究证明，浓度过高的内对照，会影响弱阳性的检出[16]，我们对内对照的稀释提高了检测的灵敏度。其次是第二是使用浓度为2000IU/ml的的HIV RNA标准物质作为盲样检测，均能成功检出，检出灵敏度符合美国FDA和欧洲对血筛核酸检测的灵敏度要求，即混合检测时单份献血者血液的检出灵敏度至少为5000IU/ml(95%检出率)[17]。国外已有研究证明，50～100人份的血浆混合物不会减弱核酸检测系统的敏感度。HIV急性感染的阳性结果一般在10000IU/ml以上[18]，所以考虑到即使RNA部分降解，11倍稀释以后的标本病毒浓度也在检测系统的灵敏度内。其次是我们和酶免检测是同步进行的，从2013年10月至2014年7月，共有21份确诊HIV阳性标本，我们的检测系统能够全部检出来，跟HIV确诊实验符合率100%，且无1例假阳性。最后是利用现有加样器对PCR实验方法的改进，既减轻工作人员的劳动强度，从混样到上机检测，354例标本共耗时约4h，手工操作的步骤，只剩下试剂的配置，离心柱的离心洗涤等，仅需时1.5h左右。又因为跟酶免检测同步进行，不影响血液的发放时间。

对于核酸检测，有2个关键点，一是要顺利将核酸提取出来，在血液标本采集和提取过程中要尽量减少核酸的降解，防止假阴性。二要防止扩增产物污染环境而引起以后的假阳性。为了开展核酸检测，我们参照临床基因扩增（PCR）检验实验室规范的要求装修了实验室，核酸检测实验室分为三个区，分别为试剂配制室、标本处理室和扩增检测室，3个室之间用缓冲间隔离。因为标本混样和核酸提取过程用到的加样器是和酶免实验共用的，为了减少环境中的RNA酶对RNA的降解，我们每天做完酶免实验后，对酶免酶免实验室进行彻底消毒，第二天早上先做核酸的混样和提取，核酸提取工作完成后，再做酶免实验。为了防止扩增后产物对环境的污染，在扩增反应前，反复检查扩增反应的8连管，确保盖子盖紧，反应完毕后，用多层密封袋将8连管密封后再带出扩增反应室，扩增反应室内的大功率风机24h开着，确保扩增反应室的负压。

核酸检测是有史以来成本最高的血液筛查项目，在我国这样一个发展中国家，地区发展差异大，全国有不少中小血站，如果未取得当地财政的额外拨款，是没有足够的经费来开展全自动的核酸检测系统的。而像我们这种半自动的核酸检测系统，充分利用了实验室现有的条件，费用低廉，虽然灵敏度和操作方便性跟全自动的商品化的核酸检测系统还有差距，但其检测的灵敏度已经高于欧盟和FDA对血液筛查HIV灵敏度的要求。实际上，根据国际输血协会输血传播传染性疾病工作组的调查，即使在发达国家的血液中心（如德国和奥地利等）除了有商品化的核酸检测系统，也有自建的核酸检测系统[19]。如何继续提高检测的灵敏度，将是我们未来研究的方向。

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Development and application of a low-cost nucleic acid screening system for the detection of blood transmitted HIV

ZHONG Zhanhua，ZOU Xiaodong，WAN Xiaochun，et al.Huizhou Blood Center，Huizhou Guangdong 516000，China.

Objective To develop a low-cost nucleic acid detection system for efficient and rapid detection of blood transmitted HIV.Methods The pipettes of ELISA experiments were used to mix blood samples and do with the nucleic acid.Accordingly，the nucleic acid was tested using HIV-1 nucleic acid quantitative detection reagents.Results There was no difference in the effectiveness of conventional methods and pipette improved methods，while the latter showed the more efficient and quicker features.Conclusion The Low-costnucleic acid screening system was able to detect blood transmitted HIV economically and efficiently，which could effectively improve the security use of blood.

Low-cost nucleic acid testing；Blood safety；PCR；HIV

R512.91

A

1674-1129(2015)06-0724-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.010

2015-09-17；

2015-11-01)

钟展华，男，1976年8月生，硕士，副主任技师，专业：医学检验，研究方向：血液安全与采供血信息化建设。