顺铂对肿瘤细胞DRAM LC3β表达的影响

姚 生 朱娴颖 许霞青 解 杰 王建超＊

（1华中科技大学附属同济医院骨外科；2华中科技大学同济医学院组织胚胎学教研室，武汉430030）

肿瘤临床治疗中癌细胞不易被彻底杀死，部分残存的癌细胞会导致日后肿瘤复发。这是临床肿瘤治疗所面临的重要问题之一。最近研究发现癌细胞的一种特殊自身保护机制——细胞自噬——可能是导致肿瘤复发的因素之一［1－5］，研究拟用体外细胞培养，MTT（细胞存活率检测）和免疫细胞化学方法证实不同浓度肿瘤化疗药物（顺铂）对癌细胞生存的影响，探讨这种影响与肿瘤细胞增殖和自噬因子：损伤调控自噬因子（DRAM）和轻链3β（LC3β）表达变化之间是否存在相关性。

材料和方法

1.细胞培养

B16－F10细胞接种于培养瓶中，使用含有6%胎牛血清的DMEM／high glucose培养基，在37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱内进行培养，每2－3d更换一次培养基。细胞生长至70%－80%丰度时，传代或用于试验。

实验分组：B16－F10细胞共分成七组：1号组为正常空白对照组，2号－7号组分别为每毫升8？倕g，16？倕g，32？倕g，64？倕g，128？倕g，256？倕g顺铂损伤组。

2.MTT细胞活力测定

取对数生长期的细胞，以每孔8000－10000个／ml细胞浓度接种于96孔培养板中，后加入100ml用6%胎牛血清的DMEM／high glucose培养基稀释的顺铂，终浓度为8，16，32，64，128，256μg／ml。对照组加100ml 6%胎牛血清的DMEM／high glucose培养基。每组5个复孔。

顺铂作用6小时后，每孔加入20μl MTT溶液（5mg／ml，即0.5%MTT），37℃、5%CO2环境下继续培养4h。终止培养，孔底有蓝紫色结晶物质析出。小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），避光37℃恒温摇床上低速振荡15 min，使结晶物充分溶解。DG－3022A酶标仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。根据下列公式计算抑制率：抑制率 %＝［（对照组 A－实验组 A）／对照组A］×100%，并根据以上结果用82798－IC50软件计算出顺铂作用的半数抑制浓度（IC50）。

3.免疫细胞化学检测

取对数生长期的细胞，以5×104个／ml细胞浓度接种于24孔板中，每孔加入500μl用6%胎牛血清的DMEM／high glucose培养基稀释的顺铂，终浓度为100、200／ml。对照组加500μl 6%胎牛血清的DMEM／high glucose培养基。每组均做3个复孔，置培养箱中继续培养，6h后，用PBS（pH 7.4）漂洗3次，多聚甲醛固定及PBS洗后，3%Triton X－100处理30min，3%H2O230min。2%BSA封闭后加入一抗，DRAM（1∶100Santa Cruz）25℃温育2小时。LC3β组使用LC3β（1∶60 Santa Cruz），25℃温育2h。二抗用生物素标记的羊抗鼠IgG工作液（1∶200），25℃温育1h；清洗后滴加SABC工作液（1∶200），25℃温育1h。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片。

结 果

1.MTT（细胞存活率检测）

图1 顺铂对肿瘤细胞存活率检测Fig.1MTT Test for the effect of cisplatin on tumor cell survival rate

MTT实验观察到随着顺铂浓度的增加和时间的延长，肿瘤细胞的存活率逐渐地下降。但在小剂量的顺铂治疗早期，细胞的存活率有一个短暂的升高。

2.免疫组织化学

图2 顺铂对肿瘤细胞NS，DRAM LC3β表达的影响 ×400Fig.2The effect of cisplatin on Expression of NS，DRAM LC3β×400

免疫细胞化学观察到NS在肿瘤细胞核或核仁表达，在用相对较低浓度顺铂（200μg／ml）培养的肿瘤细胞中，NS表达明显增强。但在相对较高浓度顺铂（400μg／ml）培养中，肿瘤细胞NS表达率明显下降（见图2）。

研究免疫细胞化学同时也观察到DRAM在肿瘤细胞的核膜周围表达，在用相对较低浓度顺铂（200μg／ml）培养的肿瘤细胞中，DRAM 表达明显增强。但在相对较高浓度顺铂（400μg／ml）培养中，肿瘤细胞DRAM阳性表达率明显减少（见图2）。

研究免疫细胞化学同时也观察到LC3β在肿瘤细胞的胞质或突起中表达，多呈颗粒状。在用相对较低浓度顺铂（200μg／ml）培养的肿瘤细胞中，LC3β表达明显增强。但在相对较高浓度顺铂（400 μg／ml）培养中，肿瘤细胞LC3β阳性表达率明显减少（见图2）。

讨 论

肿瘤治疗相关的研究常常注意的是肿瘤细胞坏死和凋亡，但是经过抗肿瘤药治疗，引起的细胞凋亡和坏死，不能很好解释肿瘤细胞在治疗以后复发的问题。近年来对肿瘤治疗的研究认为细胞自噬是导致肿瘤复发的关键［6－9］。

MTT实验观察到在低剂量顺铂治疗时，细胞的存活率有瞬间短暂上调现象。顺铂对于肿瘤细胞的生长有明显的抑制或杀伤的药理学作用，本实验观察到在较大剂量顺铂的作用下肿瘤细胞的存活率明显减少。值得注意的是在小剂量顺铂作用的早期肿瘤细胞在一个限定的低浓度的顺铂范围内，细胞的存活率却有一定的提高（见图1）。可以认为在顺铂对细胞存活率的这种影响可能提示与细胞自噬有关［10－11］。

研究观察到免疫细胞化学在顺铂（200μg／ml）培养的肿瘤细胞中，NS表达明显增强。NS在细胞核或核仁表达，是一种与干细胞或肿瘤细胞增殖有关的细胞因子。在不同浓度组顺铂的影响下，NS表达明显增高说明细胞的增殖能力或者是细胞的活力仍然存在并有一定的增强。提示肿瘤细胞虽然经过顺铂的处理，仍具有增殖的潜力［12］。

实验结果显示免疫细胞化学在顺铂（200μg／ml）培养的肿瘤细胞中，DRAM 表达明显增强。DRAM又称损伤调控的自噬因子，主要在细胞核膜或胞质表达，是一种与细胞自噬或影响P－53介导的凋亡相关的细胞因子［14］。实验观察到在顺铂的影响下，DRAM表达明显增高说明细胞受到药物的影响，增殖能力或者是细胞的活力仍然存在。提示在低浓度顺铂的影响下，细胞仍然存活。因此，可以认为DRAM表达结果可作为细胞自噬的另一重要证据［13－14］。

研究观察到免疫细胞化学在顺铂（200μg／ml）培养的肿瘤细胞中，LC3β表达明显增强。LC3β又称轻链3分子，它有两个亚型，α和β。LC3β常和RNA结合，是一种被公认的自噬标志物，免疫组化显示主要在细胞自噬小体，因此在胞质中常呈颗粒状分布。实验观察到在顺铂的影响下，LC3β表达明显增加，说明细胞受到药物的影响，提示在低浓度顺铂的影响下，细胞仍然存活并进入自噬状态［15］。因此，可以认为LC3β表达结果进一步确定在低浓度顺铂的作用下，细胞进入自噬状态的直接证据。

综合分析，可以发现在低浓度顺铂的作用下，在短时间内，肿瘤细胞可能存活率不变或轻微下降，NS，DRAM和LC3β表达增加，提示肿瘤可能进入细胞自噬状态，这对肿瘤细胞自身是一种保护。但随着时间的延长，药物浓度的加大，细胞的存活率明显下降，NS，DRAM和LC3β表达下调，提示更多的细胞进入死亡或凋亡程序。

目前临床肿瘤治疗面临着如何对化疗药物剂量或放疗剂量的进行恰当选择。过量化疗或放疗能更多的杀伤肿瘤细胞，但同时对机体自身的细胞也存在伤害。过少则有可能不能完全杀伤肿瘤细胞，使肿瘤细胞进入自噬状态，为日后肿瘤复发留下隐患。因此，在肿瘤药物应用的同时，增加一些抗细胞自噬的药物相配合，则可能为提高肿瘤的疗效提供更有意义的思路。

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