Wnt－1、Fzd－1在环磷酰胺致大鼠神经管畸形发生中的表达变化

赵春艳 管英俊 陈燕春 高海玲

（潍坊医学院组织胚胎学教研室，山东261053）

神经管畸形是由于正常的神经发育受到干扰所导致的神经管结构异常，形成脑、脊髓等中轴部位的畸形，常常是环境因素和遗传因素相互作用的结果［1］。由于神经管畸形发病率高且后果严重，其预防和治疗已成为该研究领域的热点。有报道证实环磷酰胺具有明显的胚胎毒性和致畸作用，神经管畸形尤为常见［2，3］。本课题组前期研究发现，环磷酰胺可以通过抑制神经上皮细胞的增殖、迁移、分化导致神经管畸形［4－6］，但其分子机制尚不明确。经典的Wnt／β－catenin通路失调与神经管畸形密切相关［7］。本实验在已证实的环磷酰胺致大鼠神经管畸形［3］的基础上，应用免疫荧光技术检测Wnt经典通路的起始信号分子Wnt－1及其受体Fzd－1的表达变化，以探讨神经管畸形发生的分子机制，为神经管畸形的防治提供实验依据。

材料和方法

1.实验动物

10周龄成年未经产雌性SD大鼠，体重均为220－250g，购自山东中医药大学动物中心。

2.主要药品与试剂

环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司；兔抗Wnt－1，CST公司；兔抗Fzd－1，Santa Cruz公司；Cy3标记的羊抗兔IgG，Sigma公司。

3.建模与制备切片

SD大鼠于8：00PM按雌雄2：1合笼，翌日8：00AM进行阴道涂片检查，查见精子者则记为妊娠第0d（E0d）。将所得的40只孕鼠随机分成实验组和对照组，每组20只。E13d8：00AM，实验组按15mg／kg体重向腹腔内注射环磷酰胺，对照组注射等剂量生理盐水。按照注射后的时长将实验组和对照组的孕鼠均随机分为4个组：8、12、24、48h。以断颈方式处死孕鼠，取胎鼠，同一窝别的胚胎随机选取3只，每个时间点可得15只胎鼠，经中性福尔马林固定后进行石蜡包埋，制备连续切片，厚度为5μm。

4.免疫荧光染色

切片常规脱蜡至水；0.01mol／L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）进行微波抗原修复，PBS冲洗；羊血清封闭；甩去血清，分别滴加兔抗 Wnt－1（1：100）、兔抗Fzd－1（1：50），4℃孵育过夜；PBS冲洗；滴加 Cy3标记的羊抗兔IgG（1：400），避光37℃孵育50min；PBS冲洗；滴加 Hochest33258（1：1000），避光37℃孵育20min；PBS冲洗；抗荧光淬灭封片液封片；镜下拍摄照片。

5.统计学分析

使用IPP5.1图像分析软件分析 Wnt－1、Fzd－1的累积光密度值（IOD）。所得数据均以表示，应用SPSS13.0统计软件对组间数据进行t检验比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Wnt－1在神经上皮中的表达变化

注射后8h，对照组Wnt－1阳性细胞数量少，仅见于背侧和背外侧的边缘处，腹侧表达较弱；实验组与对照组相比，阳性细胞的分布及数量均无显著差异；注射后12h，对照组中神经管背外侧的 Wnt－1阳性细胞增多，表达范围增大、强度升高；实验组与对照组相比 Wnt－1阳性细胞的分布和累积光密度值未见明显变化。注射后24h，随着神经管顶板、翼板、底板、基板的出现，对照组 Wnt－1阳性细胞数量明显增多，分布范围从背侧向腹侧扩展，遍及神经管套层的各个部分，表达强度亦显著增强；与对照组比较，实验组 Wnt－1阳性细胞极少，仅分布于顶板边缘和翼板外侧份，腹侧底板和基板表达甚弱或不表达，累积光密度值降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。注射后48h，对照组 Wnt－1阳性细胞减少，分布于顶板、翼板和基板的外侧份，神经管腹侧中央管周围阳性表达降低；与对照组比较，实验组阳性细胞极少，仅分布于顶板边缘，累积光密度值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1，3）。

图3 环磷酰胺致大鼠NTDs神经上皮细胞中 Wnt－1阳性细胞IOD分析，＊P＜0.05vs对照组Fig.3Integrated Optical Density analysis of Wnt－1positive cells in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide.＊P＜0.05 vs the control group

图4 环磷酰胺致大鼠NTDs神经上皮细胞中Fzd－1阳性细胞IOD分析，＊P＜0.05 vs对照组Fig.4Integrated Optical Density analysis of Fzd－1positive cells in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide.＊P＜0.05vs the control group

2.Fzd－1在神经上皮中的表达变化

Fzd－1在神经管上皮中的表达变化与 Wnt－1的表达变化一致。注射后8h，对照组Fzd－1阳性细胞少，仅散在于神经管背侧和背外侧；实验组阳性表达弱，与对照组比较无显著差异。注射后12h，对照组背外侧Fzd－1阳性细胞增多，表达强度升高；实验组阳性细胞分布与对照组一致，累积光密度值未见明显改变。注射后24h，神经管各部分结构逐渐形成，对照组Fzd－1阳性细胞显著增多，顶板、翼板、底板、基板均呈强阳性表达；实验组Fzd－1阳性表达极低，阳性细胞仅散在于背侧近边缘处，其余部位未见表达，与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。注射后48h，对照组阳性表达降低，阳性细胞分布于神经管顶板、翼板外侧，而翼板内侧、基板中央部位及底板处均未见表达；实验组阳性细胞较对照组明显减少，仅在背外侧边缘有少量阳性表达，其余部位均呈阴性，与对照组相比，实验组阳性细胞累积光密度值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2，4）。

图1 Wnt－1在环磷酰胺致大鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达（×200）。对照组（A，C，E，G）、实验组（B，D，F，H）；8h（A，B）、12h（C，D）、24h（E，F）、48h（G，H）。Fig.1The expression of Wnt－1in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide（×200）.control group（A，C，E，G），experimental groups（B，D，F，H），at 8h（A，B），at 12h（C，D），at 24h（E，F），at 48h（G，H）.图2 Fzd－1在环磷酰胺致大鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达（×200）。对照组（A，C，E，G）、实验组（B，D，F，H）；8 h（A，B）、12h（C，D）、24h（E，F）、48h（G，H）。Fig.2The expression of Fzd－1in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide（×200）.control group（A，C，E，G），experimental groups（B，D，F，H），at 8h（A，B），at 12h（C，D），at 24h（E，F），at 48h（G，H）.

讨 论

神经管的形成发育是细胞发生有序地增殖、分化、迁移、粘着、凋亡的结果，受到多种信号通路构成的复杂网络调控。Wnt信号通路在调节胚胎各部分发育过程中发挥重要作用［8］，与神经发生及神经系统疾病有关，是所有物种神经发育各个阶段必不可少的信号分子。

Wnt－1是一个发育相关基因，通过激活 Wnt／βcatenin经典通路参与胚胎多部位、多组织的发育。有文献报道小鼠胚胎发育时，Wnt－1主要分布在发育中的中枢神经系统，在脊髓的顶板，间脑的背侧，中脑、后脑及其交界区域均有特异的表达［9］。卷曲蛋白Frizzled（Fzd）是Wnt蛋白的受体，二者结合后可以激活细胞内信号通路，调节靶基因的表达。目前，Wnt－1和Fzd－1在环磷酰胺引起的大鼠神经管畸形中的作用尚未报道。

研究结果显示：对照组 Wnt－1、Fzd－1的累积光密度值先升高后降低，处理后24h表达最强；分布范围先扩大后缩小，从背侧顶板扩大到两侧翼板再到腹侧的基板和底板，处理后24h分布最广，处理后48h又缩小至顶板、翼板和基板的外侧份。前期实验发现对照组中处理后24h增殖细胞数量最多，而处理后48h增殖细胞数量骤减、细胞分化明显［4］，增殖细胞数量的变化趋势与 Wnt－1、Fzd－1的表达变化规律一致。说明在神经管发育过程中，背侧细胞首先分泌 Wnt－1蛋白并以自分泌或旁分泌作用与跨膜受体Fzd－1结合促使细胞增殖，随着神经上皮细胞向外周的迁移，Wnt－1、Fzd－1阳性细胞数量逐渐增多、表达范围逐步向腹侧扩大，处理后24h达到高峰，此后 Wnt－1、Fzd－1信号逐渐减弱，细胞逐步分化。在对动物脊髓发育的研究中发现，Wnt－l具有有丝分裂原活性，Wnt信号强的部位细胞表现为大量增殖，Wnt信号弱的部位细胞则表现为大量分化［1］。Fzd－1可以与 Wnt－1、Wnt－3、Wnt－3a结合激活 Wnt／β－catenin信号通路［10］，调节细胞周期。上述结果表明Wnt－1及其受体Fzd－1参与调控神经上皮细胞的增殖活动。

本研究实验组与对照组相比，Wnt－1、Fzd－1均在用药后24、48h表现为阳性表达范围缩小、表达强度明显降低，提示环磷酰胺抑制了大鼠神经上皮细胞中 Wnt－1及其受体Fzd－1的表达，干扰经典Wnt通路的传导，影响神经上皮细胞的增殖能力。前期实验结果显示环磷酰胺可以抑制神经上皮细胞的增殖并增加细胞之间的粘附［4，6］，而细胞粘附能够抑制细胞的有丝分裂原活性蛋白，使细胞增殖受到抑制，与本实验结果吻合。有文献报道小鼠Wnt－1基因不表达、过表达［11］或 Fzd－1基因突变［12］均能引起神经管闭合不全。本课题组的另一研究结果显示非经典 Wnt信号通路的 Wnt5a、Fzd2也参与了环磷酰胺的致畸过程［13］。综上所述，环磷酰胺可以干扰神经上皮细胞中Wnt信号通路的正常传导，导致神经管畸形的发生。

［1］Timothy W，Calvin S，Kingsley A，et al.The role of primary cilia in the pathophysiology of neural tube defects.Neurosurg Focus，2012，33（4）：1－8

［2］Xiao R，Yu HL，Zhao HF，et al.Developemental neurotoxicity role of cyclophosphamide on post－neural tube closure of rodents in vitro and in vivo.Int J Dev Neurosci，2007，25（8）：531－537

［3］钟惠军，高英茂.环磷酰胺对SD大鼠的致畸作用及其致神经管畸形形态发生的观察.解剖学报，1990，21（1）：107－110

［4］陈燕春，管英俊，刘焕彩等.环磷酰胺对发育中大鼠增殖和凋亡的影响.解剖学杂志，2009，32（2）：209－211

［5］陈燕春，管英俊，刘焕彩等.环磷酰胺对大鼠神经上皮细胞向神经元方向分化的影响.中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18（1）：71－76

［6］陈燕春，管英俊，刘焕彩等.环磷酰胺致大鼠神经管畸形神经上皮细胞黏附分子和微管相关蛋白doublecortin的表达变化.解剖学杂志，2011，34（5）：633－636

［7］Allache R，Lachance S，Guyot MC，et al.Novel mutations in Lrp6orthologs in mouseand human neural tube defects affect a highly dosage－sensitive Wnt non－canonical planar cell polarity pathway.Human Molecular Genetics，2014，23（7）：1687－1699

［8］Niehrs，C.The complex world of WNT receptor signalling.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（12）：767－779

［9］Joyner AL.Engrailed，wnt and Pax genes regulate midbrain－hindbrain development.Trends Genet，1996，12（1）：15－20

［10］Gazit A，Yaniv A，Bafico A，et al.Human frizzled1interacts with transforming Wnts to transduce a TCF dependent transcriptional response.Oncogene，1999，18（44）：5959－5966

［11］Miller RK，McCrea PD.Wnt to build a tube：contributions of Wnt signaling to epithelial tubulogenesis.Dev Dyn，2010，239：77－93

［12］Yu H，Smallwood PM，Wang Y，et al.Frizzled 1and frizzled 2genes function in palate，ventricular septum and neural tube closure：general implications for tissue fusion processes.Development，2010，137（21）：3707－3717

［13］刘焕彩，陈燕春，周风华等.Wnt5a及其受体Fzd2在环磷酰胺致大鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达变化.解剖学杂志，2014，37（4）：440－442