ErbB－2、PAK1及VEGF 在大肠癌中的关系及其意义研究

周 青 刘 星 王冬芽

（井冈山大学医学院病理教研室；1井冈山大学医学院实验中心；2井冈山大学附属医院，吉安343000）

大肠癌（colorectal carcinoma，CRC）居我国恶性肿瘤死因的第5位，仅次于肺癌、胃癌、肝癌和食管癌。其发病率和病死率在我国乃至世界逐年上升，且有年轻化的趋势，严重危害人类的健康［1］。与大多数恶性肿瘤一样，大肠癌的发生发展是一个多因素、多阶段共同参与的复杂生物学过程。原癌基因ErbB－2是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族的成员之一，在多种恶性肿瘤进展中起到关键作用。目前ErbB－2在大肠癌中的表达及其与肿瘤生物学行为的关系，正日益受到人们的密切关注。ErbB－2基因在正常成人一般不表达，但当受到生长因子信号刺激时，它与其他受体形成异源二聚体，磷酸化激活，进而与下游信号蛋白识别并结合，实现逐级信号转导，对细胞增殖与凋亡起重要调节［2－5］。p21活化激酶1（p21－activated kinase－1，PAKl），即 Rho 家 族 的 小 GTP 酶（small GTPases），在生长因子介导下，可以调节细胞骨架重构、细胞增殖、转化及细胞凋亡，目前人类许多肿瘤都已发现PAKl的高表达及在肿瘤治疗和预后方面的重要作用［6－10］。但在大肠癌的演化和转移中PAKl的作用机制尚未明确，以及与ErbB－2的关系尚未见报道。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是公认的内皮细胞有丝分裂原，在许多肿瘤细胞中高表达并诱导新生血管形成，促进肿瘤侵袭［11－14］。因此本研究采用western blot（免疫印迹）方法和 RT－PCR 法（逆转录－聚合酶链反应法）检测ErbB－2、PAK1及VEGF在大肠癌中的mRNA及蛋白表达，探讨三者表达在大肠癌发生演进中的关系及其作用机制，同时分析ErbB－2、PAK1及VEGF与大肠癌组织学类型、分化程度及Dukes分期等病理学参数之间的关系，以期为大肠癌的早期诊断、靶向治疗及评估预后提供理论和实验依据。

材料和方法

1.一般资料

选取我院结直肠癌根治术后病理检测确诊为大肠癌的组织标本共48例，分组如下：（1）肠癌组织组，48例，男26例，女22例，年龄31－80岁，中位年龄53岁。同时收集患者的临床资料，包括组织学分型、病理学分级、Dukes分期、有无淋巴结转移等。（2）癌旁组织组，21例，取上述癌肿患者毗邻肿瘤旁的肠粘膜组织。（3）远癌组织组，12例，取上述癌肿患者肿瘤旁10cm以外的肠粘膜组织。后二组经病理证实均无肿瘤浸润。

2.免疫印迹法检测蛋白质表达

取样品与5×上样缓冲液混合煮沸5min后上样进行SDS－PAGE电泳；电泳后以稳定18V电压，半干法电转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉TBS／T缓冲液封闭1h，加入一抗，4℃过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗孵育1h，暗室中ECL发光液覆盖膜5min，X光胶片曝光，显影，定影，PVDF膜上特异性条带经Olympus BX41凝胶成像仪扫描，记录条带强度（条带强度＝条带面积×条带密度），作相对定量分析。

3.逆转录－聚合酶链反应法检测基因表达

按EZ Spin Column RNA Purification Kit说明提取总RNA。核酸蛋白分析仪鉴定RNA样品的浓度和纯度，正常RNA的吸光度（A）260nm／280nm比值均在1.9－2.0。以提取的RNA为模板逆转录合成cDNA。反应结束后取出cDNA按1：1稀释，4℃保存。用于real time PCR的三对引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中ErbB－2的引物序列为：上游引物：CCTCTGACGTCCATCATCTC，下游引物：ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT；PAK1的引物序列为：上游引物：CGGAAGTAGCGGATCCTGGTGGTGACAATGTC，下游引物：ATCTCACAGAGCTCGAGACAATGAGGCTGG；VEGF的引物序列为：上游引物：CCTCTTTAGCCAGAGCCGGGG ，下游引物：TGGCCTTCTCCCCGCTCCAAC。经由40个循环的变性、退火和延伸，生成的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析，结果用靶基因／β－actin比值表示。

4.统计学分析

结 果

1.ErbB－2、PAK1及VEGF在各组的蛋白表达

ErbB－2在肠癌组织组的表达比癌旁组织组明显增多，癌旁组织组又比远癌组织组表达增多。PAK1在肠癌组织组表达较癌旁组织组显著增加，远癌组织表达极低。VEGF在肠癌组织的表达高于癌旁组织及远癌组织（图1、表1）。

图1 ErbB－2、PAK1及 VEGF在各组的蛋白表达（Western blot法）A肠癌组织组；B癌旁组织组；C远癌组织组Fig.1The expression of proteins of ErbB－2，PAK1and VEGF in different groups（Western blot）A group of colorectal carcinoma tissue；B group of pericancerous tissue；C group of distant tissue

表1 ErbB－2、PAK1及VEGF分别在各组的蛋白表达（）Table 1 The expression of proteins of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

表1 ErbB－2、PAK1及VEGF分别在各组的蛋白表达（）Table 1 The expression of proteins of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

条带强度（INT）Band intensity（INT）ErbB－2 PAK1 VEGF A肠癌组织组（Carcinoma tissue） 4 4183232.57±587378.18△△＊ 3879654.12±256332.02△△＊＊4219314.65±433587.02组别 （Group） 扫描次数（scanning times）△△＊B癌旁组织组（Pericancerous tissue） 4 2283766.18±376455.78△ 1336987.25±98653.20△△ 2275653.51±403731.20 78528.34±387563.71 C远癌组织组（Distant tissue） 4 1394280.24±6562.30 126987.30±32101.26 18

2.ErbB－2、PAK1及 VEGF在各组的 mRNA表达

ErbB－2在肠癌组织组的mRNA表达明显高于远癌组织组，此外癌旁组织组比远癌组织组的表达有所增多，但差异无统计学意义；PAK1、VEGF的mRNA表达在肠癌组织显著高于癌旁组织及远癌组织，PAK1远癌组织几乎未见表达（图2，表2）。

3.肠癌组织中ErbB－2、PAK1及VEGF各自的mRNA表达与蛋白表达的相关性

对ErbB－2在肠癌组织中mRNA表达及蛋白表达的相关性进行分析，结果表明ErbB－2mRNA表达及蛋白表达呈显著正相关关系（R＝0.78，P＜0.01）。PAK1在肠癌组织中的mRNA表达及蛋白表达呈正相关关系（R＝0.76，P＜0.01），前者表达较高的标本，后者表达也高。VEGF在肠癌组织中的mRNA表达及蛋白表达也呈显著正相关（R＝0.83，P＜0.01）。

4.肠癌组织中ErbB－2、PAK1及VEGF蛋白表达的相关性

对肠癌组织中ErbB－2、PAK1及VEGF蛋白表达的相关性进行分析，结果显示两两之间呈正相关关系（表3）。

图2 ErbB－2、PAK1及VEGF在各组的 mRNA表达（RT－PCR法）。：A肠癌组织组；B：癌旁组织组；C：远癌组织组Fig.2The mRNA expression of ErbB－2，PAK1and VEGF in different groups.A：group of colorectal carcinoma tissue；B：group of percancerous tissues；C：group of distant tissue

表2 ErbB－2、PAK1及VEGF在各组的mRNA表达）Table 2 The expression ofmRNA of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

表2 ErbB－2、PAK1及VEGF在各组的mRNA表达）Table 2 The expression ofmRNA of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

与远癌组织组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；与癌旁组织组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Compared with group of tissues far from carcinoma（C），△P＜0.05，△△P＜0.01；compared with group of tissues beside carcinoma（B），＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

mRNA ErbB－2 PAK1 VEGF A肠癌组织组（Carcinoma tissue） 53.23±11.25△ 67.20±19.32△△＊＊ 62.30±33.58组别 （Group）△△＊B癌旁组织组（Pericancerous tissue） 38.21±6.20 26.50±7.22△△ 28.22±7.56 30.29±10.20 2.03±0.86 23.33±8.12 C远癌组织组（Distant tissue）

表3 大肠癌组织中ErbB－2、PAK1及VEGF的蛋白表达的相关性Table 3 The correlation of expression of proteins of ErbB－2、PAK1and VEGF in CRC tissues

5.ErbB－2、PAK1及VEGF的蛋白表达与大肠癌临床病理特征的关系

在48例 Western blot检测的大肠癌组织中，ErbB－2、PAK1及VEGF的蛋白表达与肿瘤组织学分级、Dukes分期及有无淋巴结转移具有显著相关性，而与肿瘤的发生部位、肿瘤形态及组织学类型未见明显相关（表4）。

讨 论

大肠癌起病隐匿，早期常无明显临床表现，往往确诊时已到中晚期，这是其死亡率居高不下的重要原因。近年来，随着分子生物学的迅速发展，一些蛋白质分子生物标志物成为肿瘤研究的热点，应用于恶性肿瘤的早期诊断、靶向治疗及预后评估。

人类表皮生长因子受体于1978年被发现，是一族具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白质［15］。该家族成员之一ErbB－2具有固定的晶体构象，只有它可与其他受体形成异源二聚体，如EGFR／ErbB－2，ErbB－2／ErbB－3（ErbB－4），含有 ErbB－2的异源二聚体能够存在更长时间并可以更有效地向下游传递信号［16］。自1987年Slamon等首次发现ErbB－2基因在乳腺癌中存在扩增现象以来，近年已陆续发现，ErbB－2在卵巢癌、胃癌等多种恶性肿瘤的演进及靶向治疗中产生重要作用［2－5］。而有关ErbB2在结直肠癌发生、发展及预后方面的意义，近年也引起学界的密切关注，但研究结果不尽一致。国内赵东利等［17］报道大肠癌组织 ErbB－2阳性表达率明显高于癌旁组织和正常组织，阳性表达率在Dukes C和D期和有淋巴结转移者明显高于Dukes A和B期和无淋巴结转移者；同时他们的体外研究［18］还发现，ErbB－2基因siRNA重组质粒可以通过将细胞周期阻滞于G0／G1期而明显抑制结肠癌细胞的生长，促进癌细胞的凋亡。近期日本学者shin IY等［19］用免疫组织化学法检测到ErbB－2的阳性表达率为30.1%，并且认为ErbB－2可与 Cathepsin D、P53、COX－2及 Ki－67等分子联合作为结直肠癌的预后评估指标。我们的研究通过western blot法和RT－PCR法观测到，无论是ErbB－2的mRNA表达还是蛋白表达都比远癌组织明显增加（P＜0.01），同时ErbB－2的表达与肿瘤组织学分级、Dukes分期及淋巴结转移显著相关（P＜0.05）。本研究结果提示，结直肠癌中ErbB－2高表达与肠癌的侵袭与转移密切相关。这与上述报道较为一致。然而另有一些文献报道ErbB－2在结直肠癌的蛋白表达率很低，为0.6%至5%，基因扩增率也较低，并且ErbB－2的表达与结直肠癌Dukes分期、预后等均无关，不能反映浸润、转移情况［20－22］。曾瑄等认为不同的抗体和方法学以及标本的储存时间（影响染色强度）都可能是造成研究结果迥异的原因，因此期待于评分系统的统一和更大研究数据的积累。

资料显示，ErbB－2在生长因子作用下形成ErbB2－3／4异二聚体并磷酸化激活后，可与多种下游信号分子特异性识别并结合，实现细胞内的级联信号转导。若能发现其下游复杂网络中的关键信号分子，将对于生长因子－ErbBs的促肿瘤增殖等效应的调节具有重大意义。PAK1为Rho家族小鸟苷三磷酸酶（Rho－GTPase）Rac1和Cdc42下游重要的靶蛋白，参与了细胞骨架调节、细胞凋亡和细胞转化等多种生物学过程，近来研究发现它在多种肿瘤信号转导网络中起到关键的调节作用［23－24］。PAKl在大肠癌发生发展中所扮演的角色也成为学界研究热点。Zhu G［25］等发现PAKl高表达与重要的细胞骨架蛋白β－catenin（β－连环蛋白）的大量堆积呈正相关，并认为Rac1／PAK1级联控制了大肠癌细胞中β－catenin的S675磷酸化及癌细胞的整体激活。另有研究表示，在CRC细胞株中敲除PAK1会抑制β－catenin的表达、β－catenin／TCF4的转录活性以及原癌基因c－Myc的表达，阻碍CRC细胞的生长和转移［26］。同时还有学者报道，PAK1的敲除能提高CRC对5－氟尿嘧啶的化学敏感性［27］。

表4 ErbB－2、PAK1及VEGF的表达与大肠癌临床病理参数的关系Table 4 The relations between expression of ErbB－2，PAK1and VEGF and the clinical pathological parameters in colorectal carcinoma

但是在CRC中PAK1与生长因子及其ErbBs受体的关系鲜见报道。Arias－Romero LE等［28］在乳腺癌研究中发现了一条ErbB2－PAK1再到β－catenin的重要信号通路，指出这是乳房上皮细胞异常转化的有效途径。我们的研究结果显示，结直肠癌组织中PAK1的基因及蛋白表达均高于癌旁组织及远癌组织（P＜0.05）。同时实验还发现PAK1与ErbB－2的表达存在正相关关系（P＜0.05）。据此我们推测，在结直肠癌中，活跃的生长因子激活ErbB－2／3／4受体后，可能通过某种信号通路激活下游重要信号分子PAK1，增强PAK1基因的转录或转录后翻译导致其蛋白过度表达，促进肿瘤细胞迁移侵袭。

VEGF是迄今发现的最重要的促血管生成因子，而新生血管形成是肿瘤发展和浸润的必要条件。众多资料提示VEGF过表达在结直肠癌发生发展中具有重大意义［29－32］。但是有关PAK1与VEGF在肿瘤演进中的相互关系目前研究较少。有学者在乳腺癌的研究中发现，PAK1激酶抑制剂K299R的过表达会抑制VEGF促进剂的活化、VEGFmRNA表达及VEGF蛋白的分泌；相反，PAK1激动剂T423E促进VEGF表达及分泌［33］。武金宝等［34］报道，大肠癌细胞SW480中，一方面PAK1可正向调节VEGF的表达及活性，另一方面，VEGF发挥效应作用的一个途径是通过激活PAKl而起效。近年李良辉等［35］也报道，将大肠癌细胞SWlll6－Pakl稳定转染株与人脐静脉内皮细胞共培养后形成的血管数较空载体转染组显著增加，而且，VEGF的蛋白表达水平在SWlll6－Pakl稳定转染株中明显升高。上述体外研究提示，大肠癌细胞中PAK1和VEGF的表达相互促进，在大肠癌的演进发展中形成恶性循环。本研究则从大肠癌患者体内的癌组织中观测到，PAK1与VEGF的表达呈现正相关关系（P＜0.05），进一步证实在结直肠癌中PAK1与VEGF可能相互诱导调节表达，促进血管生成，加速肿瘤的转移浸润。

另有体外实验表明，ErbB－2过表达在肿瘤细胞中能增加VEGF等血管生成因子的合成与分泌，反之，用抗ErbB－2因子治疗则导致VEGF合成的显著下降［36］。近年 Chen J 等［37］报道，在结直肠癌肝转移患者中，ErbB－2及VEGF在肝转移中的阳性表达率与原发肿瘤相似，而无论在原发肿瘤，还是在肝转移中，二者表达均显著相关，并且二者皆表达阳性者较阴性表达者预后更差。我们的研究显示，大肠癌组织中ErbB－2与VEGF无论是基因表达还是蛋白表达均比癌旁组织和远癌组织增高，并且ErbB－2与VEGF的表达呈正相关，提示通过上调VEGF的表达促使血管大量生成很可能是ErbB－2在大肠癌浸润侵袭中发挥作用的重要途径。

综上所述，本研究结果提示，结直肠癌中生长因子受体ErbB－2的活化可能经由某信号途径激活下游分子PAK1及VEGF，后二者又相互协同诱导表达，共同促进了大肠癌的进展迁移，具体信号机制有待深入研究。此外ErbB－2、PAK1及VEGF的表达与CRC的病理学分级、临床分期、淋巴结转移等恶性程度及预后密切相关，提示联合检测ErbB－2、PAK1及VEGF在大肠癌中的表达对于判定大肠癌生物学行为及评估预后具有重要价值，同时说明靶向于ErbB－2、PAK1及VEGF对于CRC化学治疗药物来说可能代表了一种新的治疗策略。

［1］Jemal A，Bray F，Center M，et a1.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69－90

［2］Ou CC，Hsu SC，Hsieh YH，et al.Downregulation ofERBB2by RIG1involves the PI3K／Akt pathway in ovarian cancer cells.Carcinogenesis，2010，29（20）：299－306

［3］Roa I，Slater J，Carvajal D，et al.ERBB2gene amplification and overexpression in advanced gastric cancer.Rev Med Chil，2013，141（11）：1411－1419

［4］Lang SA，Hackl C，Moser C，et al.Implication of RICTOR in the mTOR inhibitor－mediated induction of insulin－like growth factor－I receptor （IGF－IR）and human epidermal growth factor receptor－2 （ErbB2）expression in gastrointestinal cancer cells.Biochim Biophys Acta，2010，1803（4）：435－442

［5］Cui H，Cheng Y，Piao SZ，et al.Correlation between ERBB－2／neu（erbB－2）expression level and tErbBapeutic effect of combination treatment with ERBBCEPTIN and chemotErbBapeutic agents in gastric cancer cell lines.Cancer Cell Int，2014，14（1）：10.doi：10.1186／1475－2867－14－10

［6］李深，秦华民，蓝晓艳等.神经细胞粘附分子通过P21活化激酶1促进神经突生长.中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（5）：416－420

［7］Avilova EA，Andreeva OE，Shatskaya VA，et al.The role of protein kinase PAK1in the regulation of estrogen－independent growth of breast cancer. Biomed Khim，2014，60（3）：322－331

［8］Qian Z，Zhu G，Tang L，et al.Whole genome gene copy number profiling of gastric cancer identifies PAK1and KRAS gene amplification as tErbBapy targets.Genes Chromosomes Cancer，2014，53（11）：883－894

［9］Park J，Kim JM，Park JK，et al.Association of p21－activated kinase－1activity with aggressive tumor behavior and poor prognosis of head and neck cancer.Head Neck，2014，Mar 14.doi：10.1002／hed.23695

［10］Chen H，Miao J，Li H，et al.Expression and prognostic significance of p21－activated kinase 6in hepatocellular carcinoma.J Surg Res，2014，189（1）：81－88

［11］Zhang Y，Yang H，Barnie PA，et al.Expression of Toll－like Receptor 8and Its Relationship with VEGF and Bcl－2in Cervical Cancer.Int J Med Sci，2014，11（6）：608－613

［12］Joseph RW，Parasramka M，Eckel－Passow JE，et al.Inverse Association between Programmed Death Ligand 1and Genes in the VEGF Pathway in Primary Clear Cell Renal Cell Carcinoma.Cancer Immunol Res，2013，1（6）：378－385

［13］Ling S，Deng D，Mo Y，et al.Correlations Between CT Perfusion Parameters and Vascular Endothelial Growth Factor Expression and Microvessel Density in Implanted VX2Lung Tumors.Cell Biochem Biophys，2014，29（4）：203－209

［14］洪勇，范平，邱超学等.三阴性、非三阴性乳腺癌中血管内皮生长因子－C的表达及临床意义.实用医学杂志，2012，28（14）：2306－2308

［15］Albini A，1wamoto Y.KIeinman Hk，et a1.A rapid i11 vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.Cancer Res，1987，47（12）：3239－3245

［16］Frost JA Khokhlatchev A，Stippee S，et a1.Differential effects of PAKl－activating mutations reveal activity，dependent and－independent effects on cytoskeletal regulation.J Bioi Chem，1998，273（43）：28191－28198

［17］赵东利，温玉墀，隋燕霞等.C－erbB－2蛋白在人结肠癌组织中的表达及其与临床病理关系.现代肿瘤医学，2012，2（20）：334－338

［18］赵东利，党诚学，隋燕霞等.C－erbB－2基因shRNA表达质粒对结肠癌细胞生物学行为的影响.细胞与分子免疫学杂志，2012，28（4）：371－373

［19］Shin IY，Sung NY，Lee YS，et al.The expression of multiple proteins as prognostic factors in colorectal cancer：cathepsin D，p53，COX－2，epidermal growth factor receptor，C－erbB－2，and Ki－67.Gut Liver，2014，8（1）：13－23

［20］Kovacevic D，Sonicki Z，Kusic Z，et a1.Preoperative selalm levels of c－erbB－2do not seem to be useful in management of patients with rectal cancer.1nt J Colorectal Dis，2007，22（7）：827－831

［21］Sehuell B，Gruenberger T，Scheithauer W ，et a1.ERBB－2／neu pmrein expression in colorectal cancer.BMC Cancer，2006，6：l23

［22］曾 瑄，王 鹏，武莎斐等.结直肠癌EGFR和ERBB2蛋白表达及其基因拷贝数分析.中华病理学杂志，2007，7（36）：447－452

［23］King H，Nicholas NS，Wells CM，et al.Role of p－21－activated kinases in cancer progression.Int Rev Cell Mol Biol，2014，309：347－387

［24］Ye DZ，Field J.PAK signaling in cancer.Cell Logist，2012，2（2）：105－116

［25］Zhu G，Wang Y，Huang B，at al.Rac1／PAK1cascade controlsβ－catenin activation in colon cancer cells.Oncogene，2012 ，31（8）：1001－1012

［26］Huynh N，Liu KH，Yim M，et al.Demonstration and biological significance of a gastrin－P21－activated kinase 1feedback loop in colorectal cancer cells.Physiol Rep，2014，2（6）.pii：e12048

［27］Qing H，Gong W，Che Y，et al.PAK1－dependent MAPK pathway activation is required for colorectal cancer cell proliferation.Tumour Biol，2012，33（4）：985－994

［28］Arias－Romero LE，Villamar－Cruz O，Huang M，et al.Pak1kinase links ErbB2toβ－catenin in transformation of breast epithelial cells.Cancer Res，2013，73（12）：3671－3682

［29］Tabata S，Goi T，Nakazawa T，et al.Endocrine glandderived vascular endothelial growth factor strengthens cell invasion ability via prokineticin receptor 2in colon cancer cell lines.Oncol Rep，2013，29（2）：459－463

［30］Peterson JE，Zurakowski D，Italiano JE Jr，et al.VEGF，PF4and PDGF are elevated in platelets of colorectal cancer patients.Angiogenesis，2012，15（2）：265－273

［31］Huang SM，Chen TS，Chiu CM，et al.GDNF increases cell motility in human colon cancer through VEGFVEGFR1interaction.Endocr Relat Cancer，2013，21（1）：73－84

［32］Min BS，Kim NK，Jeong HC，et al.High levels of serum VEGF and TIMP－1are correlated with colon cancer liver metastasis and intrahepatic recurrence after liver resection.Oncol Lett，2012，4（1）：123－130

［33］BagErbBi－Yarmand R，Vadlamudi RK，Wang RA，et al.Vascular endothelial growth factor up－regulation via p21－activated kinase－1signaling regulates ErbBegulinbeta1－mediated angiogenesis.J Biol Chem.2000，275（50）：39451－39457

［34］Wu JB，Han YJ，Nan QZ，et al.Effect of p21－activated kinase－1on the invasiveness of colorectal carcinoma cells in vitro.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2009，29（7）：1341－1343

［35］李良辉，吴国洋，卢毅卓等.p21－激活激酶1诱导结直肠癌转移机制的研究.中华实验外科杂志，2013，30（2）：410

［36］De Luca A1，Carotenuto A，Rachiglio A，et al.The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment.J Cell Physiol，2008，214（3）：559－567

［37］Chen J，Li Q，Wang C，et al.Prognostic significance of c－erbB－2and vascular endothelial growth factor in colorectal liver metastases.Ann Surg Oncol，2010，17（6）：1555－1563