二氮嗪对大鼠脑缺血再灌注后ZO－1和Claudin－5蛋白表达的影响

何平平 张 鸿 孙 淼

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳110004）

缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的高发疾病之一，有着较高的致死率和致残率，传统的治疗是将缺血后神经元的保护作为靶向目标，随着“神经血管单元”的概念在2001年被首次提出后，将神经元、血脑屏障、胶质细胞作为有机整体在发生缺血损伤后进行保护成为新的研究热点。

血脑屏障 （blood brain barrier，BBB）作为神经血管单元的核心结构，在限制和调节血浆组分与脑组织间相互交流中发挥关键作用。随着分子生物学的进展，Brightman等提出紧密连接（tight junction，TJ）在血脑屏障中发挥着核心作用，其功能包括加强内皮细胞间连接、封闭细胞间隙、调整各种物质扩散、参与细胞生长分化的信号的传递等。其中，Claudin－5及ZO－1是TJ的主要结构蛋白，其表达水平的变化与脑微血管通透性的改变及脑水肿的程度密切相关。

我们在前期的实验中证明KATP通道激活可以通过调控多条信号通路对缺血后神经元损伤发挥保护作用［1－4］，实验通过制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注（I／R）模型，观察线粒体KATP通道特异性开放剂二氮嗪对缺血再灌注损伤后血脑屏障紧密连接的保护作用。

材料和方法

1.实验动物

Wistar大鼠30只，♂，体重（300±20）g，普通级，由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供。

2.主要试剂

一抗由北京博奥森生物技术有限公司提供，S－P免疫组化超敏试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供，DAB显色剂及WB二抗由武汉博士德公司提供。

3.方法

3.1 动物分组及模型制作

Wistar大鼠随机分为三组：假手术组、缺血再灌注组（I／R）、二氮嗪预处理组，每组各10只。二氮嗪预处理组在缺血前连续7天给予二氮嗪（20 mg／kg）腹腔内注射。假手术组每日行同体积生理盐水溶液腹腔注射。给药停止后，应用Longa线栓法制备脑缺血模型，具体步骤如下：大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （3ml／kg），麻醉后，将大鼠仰卧位固定在手术台上行颈部脱毛，常规消毒后在颈部正中切口，分离皮下组织，充分暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉 （ICA）。在ECA与CCA分叉处结扎ECA，线栓采用直径为0.26mm、头端圆钝涂有肝素的尼龙鱼线，鱼线经CCA进入ICA约18－20mm，感觉有阻力时停止，扎紧并固定鱼线，缺血2h后将线轻轻拔出约1cm进行再灌注。假手术组动物栓线插入仅12mm，余步骤相同。24h后采用Bederson方法进行神经功能损伤评分，分数越高，说明其神经行为障碍越严重，1分≤评分＜4分为脑缺血模型建立成功。

3.2 免疫组织化学染色

大鼠在脑缺血再灌注24h后经10%水合氯醛深度麻醉，以4%多聚甲醛灌注后断头，取额顶叶皮层（去除明显的坏死组织）缺血半影区组织于4%多聚甲醛中24h后700ml／L乙醇室温保存，石蜡包埋后切片，切片厚度5μm，取各组组织的三套石蜡切片分别进行抗－ZO－1，抗－Claudin－5阳性对照染色切片，脱蜡、水化，蒸馏水洗后，微波修复30min后分别加入一抗，4℃过夜，PBS洗涤，滴加二抗，37℃孵育30min；滴加链霉素卵白素过氧化物酶（ABC），37℃孵育30min，PBS冲洗，DAB显色，水冲洗，脱水，透明，封片，在光镜下观察。

3.3 Western Blot定量检测

每组样本取等量蛋白（约50μg）分别进行匀浆，匀浆器中分别加入裂解液，1200g，40℃，离心5 min，收集上清，酚试剂法对上清蛋白进行定量，按照每泳道15μg加载于SDS－PAGE凝胶电泳孔中，以电压120V／40mA，2h，电泳后转至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗5min×3次，分 别 加 入一抗 （ZO－1、Claudin－5 抗 体或 GAPDH），4℃封闭过夜，TBST洗5min×3次，然后加入二抗（1∶10000）室温2h，TBST洗5min×3次，碱性磷酸酶法显色.以同一样本的GAPDH作为内参，凝胶图像分析仪扫描图像，目的蛋白含量 ＝ 样本目的蛋白灰度值／同一样本GAPDH灰度值.

4.统计学分析

结 果

1.免疫组织化学染色结果

如图1所示，假手术组的血管内皮细胞上ZO－1、Claudin－5沿血管均匀连续表达，缺血组血管内皮细胞上ZO－1、Claudin－5分布断续、稀少；二氮嗪处理组ZO－1、Claudin－5分布情况较缺血组明显好转。

2.Western Blot定量检测结果

图像分析软件，结果显示缺血再灌注组ZO－1及Claudin－5的蛋白表达较假手术组明显减少，二氮嗪预处理组ZO－1及Claudin－5的蛋白表达较缺血再灌注组增多（表1及图2）。

图1 二氮嗪对 MCAO模型大鼠ZO－1、Claudin－5蛋白表达的影响（箭头所示为阳性表达，SABC×400）Fig.1Effect of diazoxide on ZO－1and Claudin－5protein expression of cerebral ischemia－－reperfusion in rats（The arrows point to positive expressions，SABC ×400）

表1 各组大鼠ZO－1、Claudin－5与GAPDH总灰度比值（）Table 1 The ratio of total grey value of ZO－1and Claudin－5vs GAPDH of each group（）

表1 各组大鼠ZO－1、Claudin－5与GAPDH总灰度比值（）Table 1 The ratio of total grey value of ZO－1and Claudin－5vs GAPDH of each group（）

＊P＜0.05vs I／R group；＊＊P＜0.01vs sham group

组别（Group）5 1.05±0.26 0.09±0.08缺血再灌注组（I／R group） 5 0.39±0.12＊＊ 0.21±0.99＊＊二氮嗪预处理组（diazoxide treatment） 5 0.68±0.11＊ 0.57±0.08＊n ZO－1 Claudin－5假手术组（sham group）

图2 各组大鼠ZO－1、Claudin－5蛋白的变化（免疫印迹）Fig.2The changes of ZO－1and Claudin－5in each group（Western blot）

讨 论

血脑屏障是神经血管单元的核心结构，其通过限制和调节血浆组分与脑组织间相互交流来维持脑内环境稳态。缺血条件下可导致血脑屏障的损伤，从而进一步 加重脑 损伤［5］。有报道［6、7］血脑屏障的损伤是脑缺血早期患者死亡的主要危险因素之一。因此在急性缺血性脑损伤后选择有效的治疗策略来限制血脑屏障功能紊乱显得尤为重要。

随着分子生物学的进展，紧密连接（tight junction，TJ）在血脑屏障中所发挥的核心作用已经被充分地证明，内皮细胞间的紧密连接是由3种跨膜蛋白Claudin、Occludin、连接黏附分子（JAM）与胞浆附着蛋白（ZO－1、ZO－2、ZO－3）等共同组成的复合体［8］。一般认为，细胞与细胞之间主要在跨膜蛋白Occludin处形成TJ，而仅有Occludin的表达却不能形成TJ，而只有Claudin－5将成纤维细胞转染之后，才能在TJ上定位到Occludin蛋白，Claudin－5是紧密连接形成的充要条件［9］，Occludin则起到辅助作用。在低氧情况下，随着乏氧时间的延长，ZO－1蛋白由细胞膜上逐渐迁移到胞浆中，然后进入胞核内，造成occludin－ZO－1－F－actin连接的断裂，BBB通透性增加［10］。因此有人认为Claudin－5蛋白是脑血管内皮细胞通透性调节的最重要调节因子，而ZO－1表达水平的下降标志着BBB的破坏［5］，可以说Claudin－5、ZO－1是TJ的主要结构蛋白。在正常情况下，这两种蛋白均沿着细胞膜连续分布。

ATP敏感性钾通道（ATP－sensitive potassium channels，KATP）是一类由内向整流钾通道（Kir6.X，包括 Kir6.1和 Kir6.2）亚基和磺酰脲类受体（SUR1，SUR2A或SUR2B）亚基组成的异源性多聚体［11］，根据分布部位不同，分为细胞膜KATP通道和线粒体KATP通道，其活性除了受ATP浓度调节，还可被KATP通道开放剂激活。当线粒体基质ATP不足时，该通道开放，线粒体内膜去极化，呼吸链活性显著增强，从而提高细胞对缺血缺氧的耐受能力［12］。二氮嗪是线粒体KATP的特异性开放剂，最早被应用于心肌缺血方面的研究，其对线粒体KATP敏感性是膜KATP2000倍［13］。我们自2006年以来一直从事KATP通道开放剂对脑缺血神经元保护机制的研究。在前期体外试验中，我们发现线粒体KATP通道开放剂二氮嗪可能通过caspase依赖的通路和非caspase依赖的通路对氧糖剥夺（OGD）诱导的SH－SY5Y细胞凋亡发挥保护作用。但我们前期对KATP通道开放剂脑保护机制的研究主要集中在对神经元保护的研究。

在本次实验中，我们通过免疫组化及 Western blot定量测定的方法对比各组大鼠脑组织微血管内皮细胞上ZO－1、Claudin－5的表达情况，结果显示假手术组ZO－1、Claudin－5的表达连续、丰富，缺血再灌注组这两种蛋白的表达较假手术组明显减少，定量分析显示有统计学意义，相对于缺血再灌注组，二氮嗪预处理组的表达情况得到改善，这说明脑缺血再灌注损伤可能与构成血脑屏障紧密连接的相关蛋白ZO－1、Claudin－5表达减少有关，而二氮嗪可通过增强ZO－1、Claudin－5的表达来减轻血脑屏障的开放程度，从而对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。本研究为二氮嗪发展成为缺血性脑卒中的治疗药物提供了实验依据，同时也为神经血管单元新的靶向研究提供了实验线索。

［1］Zhang H ，Song LC，Liu YY，et al.Pinacidil reduces neuronal apoptosis following cerebral ischemia－reperfusion in rats through both mitochondrial and death－receptor signal pathways.Neurosci Bull，2007，23（3）：145－150

［2］Zhang H，Song LC，Jia CH，et al..Effects of ATP sensitive potassium channel opener on the mRNA and rotein expressions of caspase－12after cerebral ischemia－reperfusion in rats.Neurosci Bull，2008，24（1）：7－12

［3］Zhang H，Jia C，Zhao D，et al.Adenosine triphosphatesensitive potassium channel opener protects PC12cells against hypoxia－induced apoptosis through PI3K／Akt and Bcl－2signaling pathways.Neural Regen Res，2010，5（22）：1706－1711

［4］Zhang H，Zhao D，Wang Z，et al.Diazoxide preconditioning alleviates caspase－dependent and caspase－independent apoptosis induced by anoxia－reoxygenation of PC12cells.J Biochem，2010，148（4）：413－421

［5］LL Latour，DW Kang，MA Ezzeddine，et al.Early blood－brain barrier disruption in human focal brain ischemia，Ann.Neurol，2004，56：468－477

［6］Durukan A，TatlisumakT.Acute ischemic stroke：overview of major experimental rodent models，pathophysiology，and therapy of focal cerebral ischemia.Pharmacol Bichem Behav，2007，87：179－197

［7］Pardridge WM.Blood－brain barrier drug targeting：the future of brain drug Development.Mol Interv，2003，3：90－105

［8］Claude P.Morphological factors influencing transepithelial permeability：a model for the resistance of the zonula occludins.Membr Biol，1979，39：219－232

［9］Awkins BT，Davis TP.The blood－brain barrier／neurovascular unit in health and disease.Pharmacol Rew，2005，57（2）：173－185

［10］Mark KS，Dads TP.Cerebral microvascular changes inpermeability and tight junctions induced by hypoxiareoxygenation.AmJ Physiol Heart Cite Physiol，2002，282（4）：1485－1494

［11］Thrift AG.Editorial comment minor risk factors for intracerebral hemorrhage：the jury is still out，Stroke，2003，34（8）：2065－2066

［12］Paucek P，Yarov－Yarovoy V，Sun X，et al.Inhibition of the mitochondrial KATPchannel by long－chain acy－CoA esters and activation by guanine nucleotides.J BiolChem，1996，71（50）：32084－32088

［13］Garlid KD，Paucek P，Yarov－Yarovoy V，et al.Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP－sensitive channels：possible mechanism of cardioprotection CircRes，1997，81 （6）：1072－1082