脑红蛋白在家兔视网膜中的分布

杨 阳 刘 霞 曾国敏 高雪晋 梁春花 杜晓华

（1甘肃农业大学动物医学院；2甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州730070）

脑红蛋白（Neuroglobin，NGB）最早于2000年由德国科学家Burmester等［1］发现，是一种主要分布于脊椎动物的脑和视网膜中的特异性携氧球蛋白，具有储存氧气和促进氧气向线粒体扩散或直接介导氧气向线粒体传递，促进ATP的产生，维持神经元正常工作的功能［2］。近年来对于NGB的研究多集中于中枢神经系统，视网膜作为中枢神经系统的一个重要组成部分，NGB在其内部的表达及生理功能已成为国内外学者研究的热点。有研究表明，NGB在视网膜中有比其它神经组织更高程度的表达，其浓度约为脑内浓度的50－100倍［3］，而视网膜的相对耗氧量又远高于脑和其他组织，是人体内耗氧率最高的组织［4，5］，提示NGB可能与视网膜的氧利用密切相关。目前，NGB在啮齿类动物、犬、人［6－9］视网膜中的表达都有相关的报道，而对于NGB在家兔视网膜中的分布主要集中在眼球挫伤和高原吸氧［10，11］这两个方面，对于正常家兔视网膜中NGB的分布特点尚未见报道。为此，本实验采用免疫组织化学方法对NGB在正常成年家兔视网膜的分布进行研究，为进一步研究NGB在哺乳动物视网膜中的分布提供有价值的形态学资料，也可为NGB在视网膜缺氧损伤相关疾病中生理功能的研究提供理论依据。

材料和方法

1.实验动物

健康成年家兔5只，样品采集自甘肃省兰州市，海拔1510米，属亚高原环境。

2.主要试剂与仪器

器械：常规手术器械（解剖刀、解剖剪等）；生物组织包埋机：KD－BM型，浙江金华科迪仪器设备有限公司；电热恒温培养箱：DHP－9082型，上海朵弗实业有限公司；精密轮转半自动螺旋切片机：RM－2235，德国LEICA 公司；生物组织摊片机：KD－P型，浙江金华科迪仪器设备有限公司；生物组织烤片机：KD－H型，浙江金华科迪仪器设备有限公司；光学显微镜：13395H2X型，德国LEICA公司。

试剂：PBS磷酸盐缓冲液：ZLI－9062，北京中杉金桥生物技术有限公司；胰蛋白酶：T8150－25，北京索莱宝科技有限公司；甲醛和正丁醇溶液：分析纯，天津市百世化工有限公司；冰乙酸和酒精溶液：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；兔抗鼠多克隆抗体：BS－1859R，北京博奥森生物技术有限公司；免疫组化染色试剂盒：SP－9001，北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒：ZLI－9018，北京中杉金桥生物技术有限公司。

3.方法

3.1 组织切片制备

家兔宰杀后，迅速取组织，置于入Davidson固定液（95%酒精：甲醛：冰乙酸：蒸馏水比例为3∶2∶1∶2）中固定24h，用锋利的刀片在角膜上开一天窗，取出晶状体和玻璃体，处理过的眼球组织于自来水流水状态下冲5h。再按70%酒精（过夜）—80%酒精（5h）—90%酒精（3h）—95%酒精（2h）—正丁醇（过夜）—更换正丁醇（5h）的步骤操作［12］，然后石蜡包埋、制作石蜡切片。

3.2 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学染色SP法进行染色，步骤如下：石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化；PBS（0.01 mol／L，pH＝7.2）冲洗3次，每次5min；0.125%胰蛋白酶抗原修复30min；PBS冲洗2次，每次3min；每张切片加入一滴30ml／L过氧化氢阻断溶液，室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min；加入正常羊血清封闭，室温孵育15min，倾去勿洗；加入一滴相应的一抗，37℃孵育2h，PBS冲洗3次；除去PBS，加入相应的二抗，37℃孵育15min；PBS冲洗3次，每次5min；每张切片加入一滴链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液，37℃孵育15min，PBS冲洗3次，每次5min；除去PBS，滴加新鲜配制的DAB显色液，在显微镜下观察并控制显色；蒸馏水终止反应，苏木精复染、脱水、透明、中性树胶封片并拍照和镜下分析。阴性对照以PBS替代一抗进行染色。

4.免疫组化结果判定

在NIKON ECLIPSE 80i显微摄像系统中对阳性切片进行拍照，拍摄参数要统一。利用Image Pro Plus6.0图像处理软件对所获得的照片进行分析，在测量窗内对图像中的各层结构区域（Area of inter，AOI）进行面积和累积光密度值（Integrated optical density，IOD）测定，测定结果导入 Excel 2010软件计算阳性对照组各层结构区域的平均光密度值（Mean density，MD）（平均光密度＝累积光密度／面积）。阴性对照组的光密度值测定方式同上，各层结构区域MD值的测定结果均为0。

结 果

眼球的最内层是视网膜，哺乳动物视网膜由内向外可分为10层结构（图1，6），依次为内界膜、视神经纤维层、节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、外核层、外界膜、视杆视锥层和色素上皮层，其中内界膜由支持细胞的内侧端融合而成；视神经纤维层由节细胞的轴突组成；节细胞层由节细胞和无长突细胞的胞体组成；内网状层由双极细胞的轴突和节细胞的树突等组成；内核层由双极细胞、水平细胞等细胞的胞体及树突等组成；外网状层由视杆细胞和视锥细胞的轴突，双极细胞树突，水平细胞的突起组成；外核层由视锥和视杆细胞的胞体组成；外界膜由支持细胞，及神经角质细胞的外侧端融合而成；视杆视锥层，由光感受器细胞的内、外节组成；色素上皮层由色素上皮细胞组成。

成年家兔视网膜中NGB免疫阳性反应主要分布于视神经纤维层、节细胞层、内网状层、外网状层、光感受器内节段和色素上皮层，内界膜、外界膜和内核层也有阳性表达（图2）。其中，视神经纤维层的阳性表达主要为节细胞的轴突；节细胞层的阳性表达为节细胞的胞体，其胞体大小不一，轮廓清楚，免疫组化结果显示NGB表达定位于细胞质，胞核中未见阳性着色；内网状层的阳性表达主要为双极细胞的轴突和节细胞的树突；外网状层的阳性表达为视杆细胞和视锥细胞的轴突，双极细胞树突以及水平细胞的突起；色素上皮层的阳性表达为色素上皮细胞；内核层的阳性表达为双极细胞的胞体，其中胞质阳性着色较强。NGB阳性表达的细胞类型主要为光感受器细胞、双极细胞和视网膜神经节细胞，与视网膜三级神经元相一致。成年家兔视网膜的外核层和光感受器外节段未见有NGB阳性表达。阴性对照各层未见阳性表达（图5）。此外，免疫组化结果显示NGB在成年家兔视神经中也具有阳性表达（图3，4）。

利用Image Pro Plus6.0软件进行半定量分析的结果显示（表1），阳性对照组家兔视网膜视神经纤维层、节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、外核层、光感受器内节段、光感受器外节段和色素上皮层的 MD值分别为0.151±0.050、0.173±0.040、0.140±0.019、0.091±0.031、0.123±0.017、0.020±0.013、0.143±0.038、0.033±0.014、0.170±0.040。统计学分析表明，阳性对照组的外核层和光感受器外节段的MD值与阴性对照组差异不显著（P＞0.05），为阴性表达（－），阳性对照组的视神经纤维层、节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、光感受器内节段和色素上皮层的MD值与阴性对照组有显著差异（P＜0.05），具有统计学意义，均为阳性表达，而阳性对照组的视神经纤维层、节细胞层、内网状层、外网状层、光感受器内节段和色素上皮层的MD值又显著高于内核层的 MD值（P＜0.05），说明视神经纤维层、节细胞层、内网状层、外网状层、光感受器内节段和色素上皮层为强阳性表达（＋＋），内核层为弱阳性表达（＋），这一判定结果也与光镜下肉眼观察的阳性表达情况相一致。

表1 家兔视网膜各层NGB表达强度比较（）Table 1 The compare of the NGB expression intensity in adultsheep retina（）

表1 家兔视网膜各层NGB表达强度比较（）Table 1 The compare of the NGB expression intensity in adultsheep retina（）

＊阳性与阴性对照组比较，P＞0.05；＊＊ 阳性与阴性对照组比较，P＜0.05；△ 阳性对照组内比较，P＜0.05。＊Compared with negative control group，P＞0.05；＊＊ Compared with negative control group，P＜0.05；△Intra－group comparisons of the positive control group，P＜0.05

平均光密度值 Meandensity 表达强度The expression intensit y视神经纤维层（NFL）nerve fiber layer 0.151±0.050＊＊ △＋＋＋＋节细胞层（GCL）ganglion cell layer 0.173±0.040＊＊△ ＋＋内网状层（IPL）inner plexiform layer 0.140±0.019＊＊△ ＋＋内核层（INL）inner nuclear layer 0.091±0.031＊＊ ＋外网状层（OPL）outer plexiform layer 0.123±0.017＊＊△ ＋＋外核层（ONL）outer nuclear layer 0.020±0.013＊ –光感受器内节段（IS）photoreceptor inner segments 0.143±0.038＊＊ △ ＋＋光感受器外节段（OS）photoreceptor outer segments 0.033±0.014＊ –色素上皮层（PEL）pigmented epithelial layer 0.170±0.040＊＊ △

讨 论

已有研究表明，NGB在啮齿类动物、犬和人视网膜的定位除色素上皮层和光感受器外节段未见有阳性表达外，其它各层均有NGB阳性表达，主要集中于节细胞层、内网状层、外网状层、光感受器内节段的椭球体及内、外核层的核周体等神经元集中的部位［3，6－9］。本研究结果显示，NGB在家兔视网膜内界膜、视神经纤维层、节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、外界膜和光感受器内节段中均见有阳性分布，在光感受器外节段未见有阳性表达，这一观察结果与前人在啮齿类动物、犬和人的研究结果基本一致。至于NGB在哺乳动物视网膜色素上皮层中是否有表达，现有研究观点并不一致，Bentmann［13］、李耀宇［7］和Schmidt［3］等利用免疫组织化学技术证实，NGB阳性物质不存在于大鼠和小鼠的色素上皮层中，但Ostoji？倢等［8－9］应用免疫组织化学方法对人和犬视网膜内NGB的定位研究结果表明，人和犬视网膜色素上皮层中均存在NGB阳性表达，徐琼［14］等在对成年大鼠视网膜中NGB亚细胞分布的研究中发现色素上皮层中也具有NGB阳性颗粒。本研究在成年家兔视网膜色素上皮层中也观察到有NGB阳性表达，这与Bentmann等的研究结果不同，但与 Ostoji？倢和徐琼等［8－9，13］的观察结果一致，这种矛盾现象的出现可能与所用抗体及研究方法的敏感性不同有关，另外，为保证视网膜的功能，人类和大多数哺乳动物通过视网膜和脉络膜双重循环来连续供氧，内层视网膜由视网膜中央血管系统营养，外层视网膜的血供主要是由脉络膜循环支持，而脉络膜循环的血液并不直接到达光感受器细胞层，其中的氧必须经过色素上皮层才能弥散至光感受器，这也可能是NGB表达不同的原因之一。出现在色素上皮层中的NGB是由色素上皮层细胞自身产生还是NGB在神经元内产生后的运输和再分布，还有待进一步实验验证。此外，在NGB是否分布于哺乳动物视网膜外核层的问题上，现有研究结果也存在不一致的情况，冉建华［6］等采用原位杂交组织化学技术在Wistar大鼠视网膜的内、外核层中观察到强烈的NGB mRNA杂交信号，这与李耀宇［7］和 Ostoji［8］等采用免疫组化技术在SD 大鼠和人类眼球核层发现NGB免疫反应阳性物质分布相一致，但徐琼［13］等未发现外核层中具有NGB阳性颗粒。本研究结果显示，家兔视网膜外核层中未见有NGB阳性表达，这与徐琼的观察结果相一致，但与Ostoji？倢和李耀宇的研究结果不同，这种差异的出现可能也与所用抗体及研究方法的敏感性不同有关。

免疫组化半定量分析结果显示，NGB在家兔视网膜各层表达的强弱有明显差异，在视神经纤维层、节细胞层、内网状层、外网状层和光感受器内节段等部位的阳性表达强度最高，这与Schmidt等［13］对小鼠视网膜中NGB表达的研究结果一致。有研究表明，哺乳动物视网膜的视神经纤维层、节细胞层、内网状层、外网状层和光感受器内节段是视网膜组织中氧耗最集中的部位［15］，这是因为视网膜的这些部位主要由相邻二层神经元之间大量的突触联系和线粒体所构成，神经元通过相互间的突触来传递信息，以实现光电信号的转换，该过程需要消耗大量的氧，而NGB在这些部位的高表达可能与其对氧的利用和线粒体的亚细胞定位密切相关，同时，NGB自身携带的氧也可为视网膜神经元所利用进而满足上述四层对氧的高消耗。此外，徐琼等研究发现，成年大鼠视网膜突触前结构的突触小泡之间分布有较多的NGB阳性颗粒，进一步支持了NGB与视网膜耗氧有关的假设，并且提示NGB可能由神经元分泌并运输到突触小泡之间来完成复杂的生理功能。我们的研究还发现NGB在家兔视网膜色素上皮层也有较高强度的阳性表达。有研究表明，色素上皮细胞的质膜内褶可扩大色素上皮细胞与脉络膜毛细血管间的接触面积，有利于在视网膜外层与脉络膜之间营养和代谢物质的选择性转运［16］。另外色素上皮细胞还具有维生素A的转运和代谢、药物解毒、合成黑色素和细胞外基质、对光感受器外节脱落的膜盘进行吞噬消化等多种功能。色素上皮细胞的这些功能都对其自身提出了较高的能量要求，提示NGB在色素上皮层的高表达可能与其在维持正常功能活动中需要大量耗氧有关。

研究表明，NGB在视网膜的氧动态平衡中起着至关重要的作用，同时NGB的存在可以使视网膜在缺血缺氧的情况下，忍受更长的时间［17］。史少阳等［18］发现视网膜缺血后NGB转录水平迅速增高，说明NGB对缺氧的反应非常敏感，提示NGB有可能在视网膜缺氧的适应性保护过程中起重要作用。丁国鹏等［19］研究表明，在急性缺血缺氧状态下大鼠视网膜NGB含量表达升高主要集中在节细胞层，在内、外网状层也发现有少量表达升高。燕振国等［10］研究表明，在高原低氧环境下兔眼视网膜组织中NGB的表达高于平原及亚高原环境，平原地区NGB在兔视网膜内、外丛状层和光感受器内节中仅有弱表达。本实验对亚高原环境下家兔视网膜中NGB表达的研究结果表明，NGB在视神经纤维层、节细胞层、内网状层、外网状层、光感受器内节段和色素上皮层等部位的表达强度最高，在内核层表达强度较弱，提示视网膜视神经纤维层、节细胞层、内网状层、外网状层和光感受器内节段等耗氧最集中的部位对缺血缺氧的敏感性程度最高，色素上皮层细胞代谢活跃，具有特殊的吞噬作用，同时还担负着视网膜神经感觉层的生物滤过功能，这都需要较高强度的能量供给，因此对缺血缺氧的敏感性程度也最高。此外，内核层作为传递光感受器细胞冲动至神经节细胞的通路，两者都具有较大的耗氧需求，对缺血缺氧的敏感性也较高，而外核层和光感受器外节段等NGB表达呈阴性的部位则对缺氧的敏感程度最低。因此，推测NGB在视网膜各层表达的差异也可能与各层对缺血缺氧损伤的敏感程度相对应。

总之，NGB在家兔视网膜中的分布同其他动物有相似之处，亦具有其自身特点。NGB的分布和视网膜各部分的生理机能密切相关。本实验的研究结果为进一步探讨NGB在正常哺乳动物视网膜中的分布提供了一定的形态学资料，但对于视网膜损伤后NGB参与的损伤修复机理还有待于从分子和组织生物学方面的进一步研究。

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图 版 说 明

图1 NGB在家兔眼球壁的表达。R视网膜。免疫组织化学染色，标尺示100μm

图2 NGB在家兔视网膜中的表达。ILM内界膜；NFL视神经纤维层；GCL节细胞层；IPL内网层；INL内核层；OPL外网层；ONL外核层；OLM外界膜；IS光感受器内节段；OS光感受器外节段；PEL色素上皮层。↑示视神经节细胞。免疫组织化学染色，标尺示20 μm

图3 NGB在家兔视盘中的表达。↑示视神经。免疫组织化学染色，标尺示100μm

图4 NGB在家兔视盘中的表达。↑示视神经。免疫组织化学染色，标尺示20μm

图5 NGB在家兔视网膜中的表达。ILM内界膜；NFL视神经纤维层；GCL节细胞层；IPL内网层；INL内核层；OPL外网层；ONL外核层；OLM外界膜；RCL视杆视锥层；PEL色素上皮层。免疫组织化学染色，标尺示20μm

图6 家兔视网膜的结构。ILM内界膜；NFL视神经纤维层；GCL节细胞层；IPL内网层；INL内核层；OPL外网层；ONL外核层；OLM外界膜；RCL视杆视锥层；PEL.色素上皮层。HE染色，标尺示20μm

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1The expression of NGB in Eyeball wall of adult rabbit.R，retina.Immunohistochemical staining，Bar＝100 μm

Fig.2The expression of NGB in retina of adult rabbit.ILM，inner limiting membrane；NFL，nerve fiber layer；GCL，ganglion cell layer；IPL，inner plexiform layer；INL，inner nuclear layer；OPL，outer plexiform layer；ONL，outer nuclear layer；OLM，outer limiting membrane；IS，photoreceptor inner segment；OS，photoreceptor outer segment；PEL，pigmented epithelial layer.↑showed the retinal ganglion cell.Immunohistochemical staining，Bar＝20μm

Fig.3The expression of NGB inthe optic disc of adult rabbit.↑showed the optic nerve.Immunohistochemical staining，Bar＝100μm

Fig.4The expression of NGB in the optic disc of adultrabbit.↑showed the optic nerve.Immunohistochemical staining，Bar＝20μm

Fig5The expression of NGB in the optic disc of adult rabbit.ILM，inner limiting membrane；NFL，nerve fiber layer；GCL，ganglion cell layer；IPL，inner plexiform layer；INL，inner nuclear layer；OPL，outer plexiform layer；ONL，outer nuclear layer；OLM，outer limiting membrane；RCL，layer of rods and cones；PEL，pigmented epithelial layer.Immunohistochemical staining，Bar＝20μm

Fig.6The retina of adult rabbit.ILM，inner limiting membrane；NFL ，nerve fiber layer；GCL，ganglion cell layer；IPL，inner plexiform layer；INL，inner nuclear layer；OPL，outer plexiform layer；ONL，outer nuclear layer；OLM，outer limiting membrane；RCL，layer of rods and cones；PEL，pigmented epithelial layer.HE staining，Bar＝20μm