高温气相色谱法分析油脂随机酯交换反应程度研究

赵金利 汪 勇 滕英来 李爱军 张 宁

（暨南大学食品科学与工程系暨南大学—萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室，广州 510632）

高温气相色谱法分析油脂随机酯交换反应程度研究

赵金利 汪 勇 滕英来 李爱军 张 宁

（暨南大学食品科学与工程系暨南大学—萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室，广州 510632）

以大豆油和极度氢化棕榈油为原料进行酯交换反应，利用高温气相色谱法分析反应前后各种三酰甘油组成的变化，研究了不同催化剂催化酯交换反应的酯交换率，从而评判催化剂催化效果。采用此方法，利用单因素试验对Lipozyme 435脂肪酶催化大豆油与极度氢化棕榈油酯交换的参数进行了研究，得到适合的反应条件为：反应温度90℃、反应时间4 h、加酶量4%（占油脂总质量）、大豆油与氢化棕榈油质量比4∶3。在此条件下反应随机酯交换率为98.3%。

气相色谱 酯交换 Lipozyme 435脂肪酶 非均相催化

酯交换反应同氢化、分提并称为油脂的三大改性方法。与另外2种方法相比，酯交换反应是通过改变三酰甘油的脂肪酸分布，从而改变油脂的物理化学性质，如熔点、固体脂肪含量、熔融热行为、晶体微观结构、晶型等，具有不会产生异构体和反式脂肪酸等优点[1－2]。因此，该方法目前已被广泛应用于零反式脂肪酸人造奶油、可可脂、起酥油等专用油脂的制备[3－5]。根据所用催化剂的不同，酯交换反应可分为化学法和酶法。酶法催化酯交换反应条件温和，副产物少，是一个环境友好型的催化过程[6]。

国内外用于确定酯交换反应程度的方法有很多，如熔点法[7]、固体脂肪含量法[8]、薄层色谱法[9]、利用液相分析三酰甘油组成分析法[10]等。但是，利用毛细管法测定的熔点区间广，试验重复性差；固体脂肪含量法受温度影响较大，导致试验误差较大[11]；薄层色谱法需通过分析油脂中2－位脂肪酸变化来判断酯交换反应的发生，操作较为繁琐；液相色谱法受检测器的影响较大，比如饱和甘油酯在紫外检测器响应值较低，示差检测器受环境影响较大，灵敏度较差，而蒸发光检测器的响应值和样品浓度非直接线性关系[12]。气相色谱法（GC）目前已被普遍使用于各类物质的定性定量分析，而且与液相相比，气相具有操作简便、分离效果好、价格低廉等优点。三酰甘油不经过衍生化，即可通过高温气相色谱法分析测定，采用氢火焰检测器，可用归一法方便地计算三酰甘油各组分的含量[13]。

研究以气相色谱法分析化学酯交换和酶法酯交换的酯交换程度，通过反应前后三酰甘油组分的相对含量变化情况推导反应的进程，并在此基础上，将该分析方法，用于固定化脂肪酶Lipozyme 435催化大豆油与极度氢化棕榈油酯交换反应的单因素试验，判断反应的程度。采用大豆油与极度氢化棕榈油酶法酯交换，获得的酯交换产品，由于来源植物油，所以产品中不含有动物油脂中胆固醇，有利于饮食健康。同时由于2种油脂的C16和C18脂肪酸含量差异较大，有利于产品形成更加稳定的β’结晶，从而具有应用于食品专用油脂的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

一级大豆油（酸价为0.15 mg KOH/g）：广州益海嘉里有限公司；极度氢化棕榈油（酸价为3.31 mg KOH/g）：广州美晨集团股份有限公司；Lipozyme 435脂肪酶：诺维信（中国）生物技术有限公司；氢氧化钠：市售化学纯；甲醇钠为分析纯：上海百灵威科技有限公司；柠檬酸为分析纯：天津市大茂化学试剂厂；固体酸（SO42－/ZrO2－Al2O3）：实验室自制[14]；甘油（≥99%）、正己烷、丙酮均为分析纯：天津市富宇精细化工有限公司。

1.1.2 主要仪器

GC－7820A气相色谱：美国Agilent公司；SZCL－2数显智能恒温磁力搅拌器、SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；MP502B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；RE－52AAAA旋转蒸发仪：上海嘉鹏有限公司；HC－2518高速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料脂肪酸组成分析

甲酯化方法参照GB/T 17376—2008，利用气相色谱法（GC）分析大豆油与极度氢化棕榈油的脂肪酸组成。

气相色谱条件：DB－wax毛细管柱（10 m×0.1 mm×0.1μm），进样量0.5μL；进样口和检测器温度均为240℃，分流比50∶1，压力20 psi；载气为高纯N2，流速 0.17 mL/min，H2流速 40 mL/min，空气流速300 mL/min；柱箱升温程序：100℃为初始温度，以10℃/min升温至220℃后保持2min，再以40℃/min升温至240℃并保持4 min。

1.2.2 氢氧化钠催化甘油解

按照大豆油和极度氢化棕榈油的质量比为3∶2，称取50.0 g的大豆油与极度氢化油棕榈油置于250 mL的圆底烧瓶中，加入0.2%NaOH（所用质量比均基于大豆油和极度氢化油棕榈的总油重）催化剂和14%甘油，在200℃抽真空条件下，反应60 min。当反应结束后加入0.6%柠檬酸水溶液进行中和。旋转蒸发除去水分，得到单甘酯、甘油二酯、三酰甘油的混合物。

1.2.3 固体酸（SO42－/ZrO2－Al2 O3）与脂肪酸催化酯化与酯交换

选择大豆油与氢化棕榈油质量比为3∶2，称取50.0 g的大豆油与氢化棕榈油，加入0.2%固体酸、10%油酸和20%甘油，并在200℃条件下抽真空反应3 h，反应结束后将产物离心除去催化剂，得到最终产物。

1.2.4 甲醇钠催化酯交换

按照底物质量比为3∶2，称取50.0 g的大豆油与极度氢化棕榈油置于250 mL圆底烧瓶中，在110℃和抽真空条件下干燥60 min后，常温冷却至80℃。加入0.2%的甲醇钠作为催化剂，通过恒温磁力搅拌器控制温度（110℃）和搅拌转速（300 r/min），并在抽真空条件下反应60 min。反应结束后，加入0.6%柠檬酸水溶液进行中和，并用70℃左右的热水洗去所生成的柠檬酸钠。

1.2.5 酶法催化酯交换

称取一定量的油脂混合物于圆底烧瓶中，加入一定比例的Lipozyme 435脂肪酶，通过恒温磁力搅拌器控制温度和搅拌转速（300 r/min），并在抽真空条件下反应一定时间，具体反应条件见表1。反应完全后，通过离心除去固定化酶，得到酯交换产物。

1.2.6 气相色谱法分析三酰甘油组成

美国Agilent7820A气相色谱仪；检测器：氢火焰离子检测器；色谱柱：DB－1ht（15 m×0.25 mm，0.1 μm）；程序升温：在50℃保持1 min，以50℃/min升温至100℃，以80℃/min升到220℃，以30℃/min升到290℃，以50℃/min升到330℃保持2 min，最后以50℃/min升到380℃保持3 min；进样口和检测器温度均为380℃。以各物质出峰的峰面积为基数，采用归一法计算各个组分的相对含量。

1.2.7 酯交换率表示方法

以酯交换反应前后样品中三酰甘油的含量变化为指标，对酯交换反应程度进行研究。其中三酰甘油的理论含量是在原料脂肪酸组成基础上，通过概率（100%随机）计算得出，酯交换率见式（1）。

式中：A1为选择的某三酰甘油在原料中的含量；A2为完全随机酯交换反应的理论值，可以通过计算获得；A3为该三酰甘油在酯交换反应后的实际含量，通过气相色谱分析获得。由式（1）可知，当A3＝A2时，酯交换率等于100%，达到了完全随机酯交换[15]。

2 结果与讨论

2.1 DB－1ht色谱柱的分离原理

甘油酯具有一定的极性和很高的碳数与沸点，所以利用气相色谱法分析该类物质时，要求耐高温且具有良好惰性的低流失色谱柱。DB－1ht是一类耐高温（最高耐温达400℃）的非极性柱，弱极性物质易与固定相发生分离，可以对TAG分子按照绝对碳数的多少进行分离，对于相同碳数的TAG，若双键不同，则无法进一步分离。另一方面三酰甘油成分的分析需要较高温度（380℃），柱温对柱效的影响较大，当温度升高时，传质阻力减小，分子扩散增加，有利于柱效的提高[16]。所以综合考虑，选择利用非极性柱DB－1ht直接分析未衍生化处理的甘油酯混合物。利用气相色谱法分析三酰甘油组成的谱图如图1所示。

图1 大豆油和极度氢化棕榈油进行随机酯交换后所得产品中三酰甘油组成的气相色谱图

由于气相色谱中三酰甘油的出峰顺序与当量碳数及沸点有关，因此，根据气相色谱的出峰时间可以推测出三酰甘油的组成成分。由图1可知：7～9 min出峰为甘油二酯，9～11 min为三酰甘油[13]，结合原料的脂肪酸组成，从左至右依次为C16C16C16、C16C16C18、C16C18C18、C18C18C18三酰甘油的峰。

2.2 原料脂肪酸组成

原料脂肪酸组成的气相分析结果如表2所示。其中大豆油主要成分为C18不饱和脂肪酸，而极度氢化棕榈油中无不饱和脂肪酸存在。故极度氢化棕榈油中三酰甘油为S3（三饱和甘油酯）型，熔点较高，晶体颗粒较大。

表2 大豆油和氢化棕榈油的脂肪酸组成（%）

大豆油与极度氢化棕榈油以不同质量比混合，在原料脂肪酸组成基础上，通过概率（100%随机）计算，完全随机酯交换后三酰甘油的理论值见表3。

表3 大豆油与极度氢化棕榈油以不同质量比例酯交换后三酰甘油理论含量

2.3 酯交换反应检测指标的选择

选择C16C16C16三酰甘油和C16C18C18三酰甘油为指标，当大豆油和极度氢化棕榈油以不同质量比混合时，三酰甘油在反应前的含量与完全随机酯交换后的理论值如表4所示。从表4可以看出C16C18C18三酰甘油的含量在酯交换反应后比反应前显著增加，最大增加量可达17.3%，而C16C16C16三酰甘油含量则相对降低，但是降低不明显。因此选择C16C18C18三酰甘油含量变化为指标，当其接近于理论值时，酯交换率接近于100%，可视为完全随机酯交换。这会引起产物中S3、U3（三不饱和三酰甘油）含量的降低和U2S、S2U含量的增多，进而改善油脂的固体脂肪含量、热力学性质和晶型等物理化学性质，因此完全随机酯交换后的产品适宜开发为功能性油基料[17]。

表4 大豆油和极度氢化棕榈油在反应前与完全随机酯交换后对应的三酰甘油相对含量/%

2.4 不同类型催化剂对酯交换反应的影响

从图2中可看出，甲醇钠和固体酸这2种催化剂的效果较差，酯交换率少于30%。这可能是由于原料中极度氢化棕榈油的酸价较高，而甲醇钠作为一种强碱性催化剂，对于原料酸值要求很高，易与混合油料中的游离脂肪酸发生皂化反应，从而失去催化活性。而甲醇钠催化反应温度较低，使得总体酯交换率不高。固体酸单独催化原料进行酯交换反应时不易进行，而对于酯化反应则较易进行，因此加入油酸和甘油进行酯化，利用生成的单甘酯促进酯交换反应，但酯交换率仍较低[14]。本研究证实，固体酸（SO42－/ZrO2－Al2O3）虽然可以催化脂肪酸和甘油进行酯化反应，但是对于催化油脂酯交换活性较低。氢氧化钠和Lipozyme 435催化大豆油和极度氢化棕榈油的酯交换率分别为93.5%和97.0%，催化随机酯交换活性较高。但前者做催化剂时需在高温下反应（＞180℃）且反应后所生成副产物的去除步骤繁琐，比如需要中和催化剂，水洗干燥等后续步骤。而酶法催化反应条件较温和（≤100℃）且催化剂易与产物分离。因此选择Lipozyme 435酶作为酯交换反应的催化剂。

图2 不同催化剂对大豆油和极度氢化棕榈油酯交换程度的影响

2.5 Lipozyme 435脂肪酶催化酯交换

2.5.1 反应温度对酯交换反应程度的影响

在酶添加量为4%，反应时间4 h，大豆油与氢化棕榈油质量比为4∶3的条件下，考察不同反应温度对酯交换反应的影响。

图3 温度对酶催化大豆油和极度氢化棕榈油酯交换反应程度的影响

从图3可知，不同的反应温度对酶催化酯交换反应影响较大，当温度从60℃升到90℃时，酯交换率显著增加，并在90℃时达到98.3%，接近完全随机酯交换。之后，酯交换率随着温度的继续升高而降低。由于Lipozyme 435酶是一种固定化脂肪酶，其空间构象更为稳定，最适温度显著提高[18]。随着反应温度的升高，酶与底物分子间的碰撞频率也相应增大，从而加速反应的进行；但当温度超过90℃时，酶的空间构象容易发生改变从而降低酶活性[19]。综合考虑选择最适反应温度为90℃。

2.5.2 反应时间对酯交换反应程度的影响

在大豆油与极度氢化棕榈油质量比为4∶3，酶添加量4%，反应温度90℃条件下，分别在不同的反应时间进行取样分析。从图4可看出，在3 h前，随着反应时间的延长，其酯交换率快速增加；在4 h可达到98.3%，已发生完全随机酯交换；之后，随着时间的继续延长，酯交换率反而降低。这可能是由于Lipozyme 435酶催化有助于反应体系中C18C18C18三酰甘油中的十八酸转变为十六酸且稳定[20]，从而引起酯交换率的降低；另外，由于酯交换反应是一个热力学平衡过程，反应活化能随着随机化程度的增加而变小，因此酯交换反应速率也随之变小。故综合考虑，选择最适反应时间为4 h。

图4 时间对酶催化大豆油和极度氢化棕榈油酯交换反应程度的影响

2.5.3 酶添加量对酯交换反应程度的影响

在反应温度为90℃，反应时间4 h，大豆油与氢化棕榈油质量比为4∶3的条件下，考察不同酶添加量对酯交换反应的影响。

图5 酶添加量对酶催化大豆油和极度氢化棕榈油酯交换反应程度的影响

由图5可知，当酶添加量小于4%时，随着酶量的增加，酯交换率显著提高。这是由于随着酶量的增加，酶与底物之间的接触面积相应增大，加快了酯交换反应的进行。当酶添加量达到4%之后，酯交换程度变化趋于平缓，其酯交换率为98.3%，已经完全随机酯交换。继续增加酶添加量，不仅会增加生产成本，而且会导致酰基转移及副产物含量的增加。综合考虑，选择4%为最适加酶量。

2.5.4 大豆油和极度氢化棕榈油不同质量比对酯交换反应程度的影响

在反应温度为90℃，反应时间4 h，酶添加量为4%的条件下，考察不同大豆油和极度氢化棕榈油质量比对酯交换反应的影响。

从图6可知，当大豆油与极度氢化棕榈油质量比小于4∶3时，酯交换率随着大豆油含量的增多而增大，然而随着混合油脂中大豆油所占比例的继续增加，在相同反应条件下，随机酯交换程度有所下降。从表4理论的C16C18C18含量可以看出，C16C18C18理论值相对比较稳定，在41.9%～44.4%之间波动。当大豆油与极度氢化棕榈油质量比为4∶3时，即两者的摩尔比值最接近1∶1，从化学反应原料而言，最利于随机酯交换的进行。考虑到完全随机酯交换率，以及采用植物来源油脂随机酯交换替代动物油脂的脂肪酸组成等各方面指标，因此选择最适底物质量比为4∶3，此时酯交换率为98.3%。

图6 混合物油料比对酶催化大豆油和极度氢化棕榈油酯交换反应程度的影响

3 结论

3.1 以反应前后C16C18C18三酰甘油含量的变化为指标，比较不同催化剂催化大豆油和极度氢化棕榈油的随机酯交换反应程度，以Lipozyme 435酶催化酯交换反应效果最好。

3.2 以反应前后C16C18C18三酰甘油含量变化为指标对Lipozyme 435酶催化酯交换反应进行分析，并通过单因素试验，得到最适反应条件为：反应温度90℃，反应时间4 h，酶添加量4%，大豆油与氢化棕榈油质量比4∶3。在该条件下混合油料酯交换率可达到98.3%，已达到完全随机酯交换。

3.3 利用气相色谱法分析酯交换反应程度具有可操作性强，方法简便，准确性高等优点，非常适合用于随机酯交换反应程度的确定。

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Analysis of the Degree of Oil Random Interesterification by High Temperature Gas Chromatograph

Zhao Jinli Wang Yong Teng Yinglai Li Aijun Zhang Ning

（Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangdong Saskatchewan Oilseed Joint Laboratory，Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632）

The catalytic interesterification of soybean oil with fully hydrogenated palm oil has been studied in the paper.High temperature gas chromatograph was utilized to investigate the degree of interesterification of different catalyst.The reaction conditions of using Lipozyme 435 as catalyst was optimized by Single Factor Method experiments；the optimum conditions were temperature of 90℃，time of 4 h，enzyme dosage of 4% （of the total oil mass），and mass ratio of soybean oil to fully hydrogenated palm oil of 4∶3.On the optimum conditions，the rate of random interesterification could be 98.3%.

gas chromatograph，interesterification，Lipozyme 435，heterogeneous catalysis

TQ641

A

1003－0174（2015）10－0117－06

广东省战略性新兴产业核心技术攻关（2012A080800 013）

2014－05－15

赵金利，女，1989年出生，硕士，功能油脂

张宁，女，1975年出生，副教授，食品专用油脂汪勇，男，1977年出生，研究员，油脂生物炼制