HCMV感染与人神经胶质瘤相关性研究

王 彬 石景柱 易 良 钟 诚（通讯作者）

1）重庆市永川区人民医院神经外科 重庆 402160 2）第三军医大学大坪医院神经外科 重庆 400042

脑胶质瘤是颅内较常见的一种恶性肿瘤，占成人颅内肿瘤的40%～50%。多形性胶质母细胞瘤，不足5%患者能够达到5a的生存期，平均生存期仅26～52周［1-2］。本文研究HCMV 感染和脑胶质瘤的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择我院神经外科2010-05—2012-02 胶质瘤患者的手术标本68例，男35例，女33例；年龄4～75岁，平均（38．5±3．5）岁；其中少突胶质细胞瘤11例，Ⅰ级星形细胞瘤7例，Ⅱ级星形细胞瘤13例，Ⅲ级星形细胞瘤18例，Ⅳ级星形细胞瘤13例，间变少突胶质细胞瘤6例。选取65例外伤脑组织为对照研究，女31 例，男34 例；年龄5～73岁，平均（37．5±3．0）岁；以上患者术前未进行任何特殊治疗，也无其他系统的肿瘤病史。见表1。

表1 2组一般资料比较

1．2 试剂和标本 蛋白酶K、氯仿、苯酚、醋酸钠、异丙醇、无水乙醇等均于国内厂家购置；DNA 分子量Marker、PCR Master Mix（北京全式金生物技术有限公司生产）。选择所培养的已经感染HCMV 的肺成纤维细胞的DNA 阳性对照，人肺成纤维细胞的DNA 阴性对照、同时选择离子水作空白对照。选择65例脑外伤病人的脑组织DNA 进行比较。手术切除组织后立即置入无菌冻存管冻存待检。

1．3 方法

1．3．1 DNA 提取：均在超净工作台上进行组织的总DNA提取操作。切割-80 ℃保存组织小块放入Ep管内，使用消毒剪剪碎组织后立即加入500μL 的细胞裂解液、4mL 蛋白酶K，于37 ℃的水浴中过夜处理；使用等体积饱和酚、氯仿和异戊醇依次萃取DNA，使用5μL 3mol·L-1pH 5．2的醋酸钠和1mL 的预冷无水乙醇-20 ℃沉淀DNA 过夜处理；离心后于预冷80%的乙醇洗盐中，先使用200μL 的TE 缓冲液溶解DNA，再用0．8%的琼脂糖凝胶进行电泳处理，再检测DNA 的提取质量；使用紫外分光光度计将DNA 的终浓度定量调整至0．1μg·μL-1，-20 ℃环境保存备用。

1．3．2 PCR 扩增：选择20μL 的扩增体系。事先对所有的样品进行β-actin的PCR 扩增分析DNA 的质量。采用外引物扩增体系和条件：PCR MasterMix 2μL，组织DNA 1μL，下游外引物0．4μL，上游外引物0．4μL，加入无菌双蒸水到20μL。反应管置入PCR 仪进行扩增，具体参数：94℃5min变性，每个循环94 ℃40s，然后56 ℃40s，再72 ℃40s，循环25次后，延伸72 ℃10min。内引物扩增反应体系及参数同上，循环30次最后延伸，72 ℃10min。2%的琼脂糖凝胶100V 电泳30min，于紫外灯下进行观察，采用凝胶成像系统进行拍照。

1．4 统计学方法 采用SPSS 13．0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用卡方检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

正常脑组织中未见到HCMV 基因片段，而胶质瘤脑组织的63例DNA 中扩增出HCMV 基因片段，5例未扩增出HCMV 片段，其中4例Ⅰ级星形细胞瘤，1例Ⅱ级星形细胞瘤。见表2。

表2 正常脑组织与胶质瘤脑组织PCR 扩增结果HCMV 阳性率比较

3 讨论

HCMV 是一种疱疹病毒科的β属双链DNA 病毒，完整的基因组约235kbp，一共编码约165个基因。其中HCMV是胞内寄生的病毒，正常人群普遍对其易感。处于隐性感染时病毒并不会复制，也不会产生细胞的病理损害；而当病毒发生活化后则可以复制和传播，基因组整合会导致宿主细胞发生恶性转化［3-4］。研究表明，HCMV 是一种致瘤因素，参与多种肿瘤发病，特别是与结直肠癌、宫颈癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤的关系极其密切［5-6］。本研究结果显示，68例患者中，63例检测出HCMV 基因，65 例正常的脑组织中未检测出HCMV 基因，2 组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。胶质瘤脑组织的63例DNA 中扩增出HCMV基因片段，5例未扩增出HCMV 片段，其中4例Ⅰ级星形细胞瘤，1例Ⅱ级星形细胞瘤。HCMV 能够通过促进cyclin E和cyclin D1的过表达而引起DNA 的复制发生异常以及细胞周期的失调。发生于S期的感染则会导致细胞周期的阻滞，使细胞开始异常增殖，促进了肿瘤的发生，抑制凋亡［7-11］。近年，国外的多家机构使用免疫组化和原位杂交以及RT-PCR技术陆续从脑胶质瘤的标本中分离出HCMV 的特异性抗原和相关的DNA 片段，明确HCMV 在脑胶质瘤中是存在的［12-13］。Miller［14］分别使用暴露在HCMV 的特异 性抗原免疫细胞以及针对HCMV 抗病毒的药物对脑胶质瘤患者进行治疗，结果显示，患者生存期有明显延长，且通过MRI也确认病灶有明显的缩小趋势。说明针对HCMV 进行治疗，可明显改善脑胶质瘤患者预后情况［15-16］。最新研究显示，HCMV 能诱导关键细胞调控通路障碍以及细胞发生恶性转化，具有致瘤性，如引起细胞周期的调控失常、基因突变、抑制或促进细胞的凋亡、细胞免疫耐受、新生血管的形成、调控宿主合成分泌细胞因子等。Maussang等将经US28基因转染的鼠成纤维细胞（NIH 3T3细胞）接种在裸鼠的皮下组织，3周后所有经接种的裸鼠均形成肿瘤，同时空白对照以及阴性对照则未见到肿瘤，由此可见HCMV 感染具有致瘤性。Cobbs将HCMV 转入胶质瘤细胞，能够促进胶质瘤细胞的生长，同时增强肿瘤的侵袭性。研究显示，HCMV 的感染会在胶质瘤的发生以及发展中起关键作用。近几年文献报道，胶质瘤干细胞、神经干细胞和脑胶质瘤间存在一种紧密内在联系。由于神经干细胞的自身基因突变或是转染外源性的基因等可导致恶性转化至胶质瘤干细胞，被称为脑胶质瘤“种子”细胞，在起源、转移、发展和复发及治疗的敏感性等问题上有决定性作用。

综上所述，少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤患者存在HCMV 的感染，其感染的可能在胶质瘤的发生以及发展中起重要作用。

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