rhIGF-1对糖尿病脑病模型大鼠认知功能的影响

李新满 胡义平

河南南阳市第二人民医院神经内科 南阳 473000

本实验通过建立实验性糖尿病脑病动物模型，观察视海马神经元AKt及PI3K mRNA 表达的变化，探讨其在糖尿病脑病病理变化中的作用机制，证实rhIGF-1 对糖尿病脑病（DE）保护作用及机制，为临床治疗DE提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 实验动物分组及模型建立 由郑州大学动物实验中心提供的成年3月龄健康Wistar雄性大鼠，体质量180～250 g，共45只。将实验动物随机分为3组：正常组、模型组、治疗组，参考Li等［1］方法建立DE 模型。实验期间自由饮食、水，注意通风、干燥和清洁，保持安静。3月后通过经鼻腔入脑给药rhIGF-1（溶于0．5mL 生理盐水）1周，2次／d。实验过程中弃去不符合诊断标准的大鼠。

1．2 MAZE-I Y 型电迷宫试验 参照王跃春等［2］报道的测定学习记忆的方法进行学习记忆能力测试，统计大鼠学习记忆错误反应频率，以百分比表示。

1．3 取材及切片制作 电迷宫实验后，麻醉动物，断头置于冰台上，取出海马，4%的多聚甲醛中固定，石蜡包埋。其余动物直接取脑组织海马区，置于—80 ℃液氮中保存。

1．4 脑组织HE 染色 常规石蜡切片脱蜡至水化，苏木精溶液染色，酸水及氨水分色，梯度酒精中脱色，再用酒精伊红染色，然后脱水、透明，最后中性树胶封固，光镜下观察CA1区神经元细胞数量变化。

1．5 免疫组化法检测大鼠海马PI3K 和AKt的表达 室温孵育10min在3% H2O2中，用柠檬酸缓冲液热修复抗原15 min，37 ℃下用山羊血清封闭10min，继之用兔抗大鼠PI3K（1∶200）和AKt抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜。充分洗涤后用生物素标志的二抗37 ℃孵育，滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，最后DAB 显色。染色设PBS（代替一抗）作阴性对照。最后Imagine pro plus软件测定其灰度值。

1．6 RT-PCR检测PI3K 和AKt mRNA 的表达 大鼠海马RNA 常规方法提取，测定其总RNA 浓度及计算纯度。采用RT-PCR检测PI3K mRNA、AKt mRNA 的表达。PI3-K：上游5’GAGTCCTATTGTCGTGACTGTTGG 3’，下 游：5’AAGCCTGAGGTTTCCTAGTTGAT 3’，预扩增长度233bp；AK：上游5’TGCTGGAGGACAATGACTAC 3’，下游5’CACGATACCGGCAAAGAA 3’，预扩增长度277bp；GAPDH：上 游：5’GAGCCAAAAGGGTCATCATCTC 3’，下游引物序列5’AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTC 3’，预扩增长度542bp。使用RT-PCR 试剂盒进行反转录扩增。PCR 产物电泳后对目的条带进行密度分析。

1．7 统计学处理 应用SPSS 17．0软件包，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用t检验及单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 rhIGF-1对大鼠学习记忆能力的影响 模型组大鼠（每组6只）学习记忆错误反应率（4次，20%）明显高于对照组（1次，5%），但经治疗后，治疗组大鼠学习记忆错误反应率（2次，10%）明显低于模型组（P＜0．05）。

2．2 rhIGF-1对大鼠海马病理改变的影响 HE 染色显示，正常组海马区神经元细胞排列整齐，胞体圆形，核染色质着色均匀。模型组大鼠海马区神经元细胞排列紊乱，数量减少，变性细胞呈不规则形状，部分神经元胞核或胞浆缺失，呈空泡状。与模型组组比较，治疗组大鼠海马区神经元细胞排列较整齐，细胞数量明显增多，变性细胞减少。见图1。

2．3 免疫组化检测rhIGF-1对大鼠海马PI3K 和AKt蛋白表达的影响 PI3K 和AKt蛋白治疗组表达呈强阳性，胞质或包膜出现棕黄色颗粒，阳性表达率为82．3%和80．6%（P＜0．01），而模型组阳性表达率明显下降为41．7% 和40．1%，差异统计学亦有意义（P＜0．01）；但治疗组和对照组相比差异无统计学意义（P＝0．456＞0．05）。见图2。

2．4 PT-PCR结果 海马区PI3K 和AKt mRNA 的表达变化：模型组大鼠海马区PI3K、AKt mRNA 表达明显低于正常组（P＜0．01），治疗后大鼠海马区PI3K 及AKt mRNA 的表达高于模型组组（P＝0．028），治疗组和正常组比较差别无统计学意义（P＝0．763）。见图3、图4。

图1 各组大鼠海马区HE染色（×400）

图2 免疫细胞化学染色检测AKt及PI3K 的表达（S-P，×400）

图3 RT-PCR检测AKt及PI3K 基因转录水平

图4 各组大鼠海马AKt及PI3K mRNA 的相对表达量

3 讨论

糖尿病脑病患者以轻、中度认知功能障碍为主要表现，认知功能损害主要在联想记忆、学习技能及注意力方面。其发病机制可能与脑老化过程中神经因子缺失相关，胰岛素样生长因子Ⅰ／Ⅱ、NGF、胰岛素的表达下降［3］。IGFⅠ／Ⅱ与其受体结合后主要通过PI3K 通路激活神经细胞内的信息转导，维持神经元存活；反之，在凋亡等损伤刺激因素的作用下，神经营养因子缺乏可使神经元功能受损而发生凋亡［4］。PI3K／Akt信号转导通路参与许多生物学功能，包括细胞代谢、细胞生存、细胞凋亡等，在认知功能障碍的研究中发现，海马神经元由于Akt表达的减少，导致神经元处于凋亡或凋亡前期状态［5］。本实验结果显示，我们观察到模型组大鼠海马CA1区细胞凋亡明显，大鼠的认知功能严重受损，大鼠海马CA1区AKt及PI3K 的表达较正常对照组明显减少，与相关报道结果吻合。因此，PI3K／AKt信号通路对糖尿病脑病患者有重要的意义，通过调控PI3K／Akt信号通路的活性可以影响细胞的凋亡，最终达到改善老龄化记忆功能减退的目的［4-5］。

rhIGF-1是一种强烈的促合成因子，进入血液后与胰岛素样生长因子结合蛋白结合，调节IGF-1受体水平，激活PI3K／AKt信号通路，维持神经细胞和神经胶质的存活，保护神经，常用于各种类型的神经损伤疾病的治疗［6］。本实验结果显示，我们观察到治疗组大鼠海马CA1区细胞数量增多，海马CA1区AKt及PI3K 的表达较模型组表达增多，大鼠的认知功能明显改善。因此，特异性激活PI3K-Akt信号通路是干预糖尿病脑病的潜在靶点［7］。

综上所述，rhIGF-1 鼻腔给药可增加大鼠海马PI3K／Akt的表达，改善了大鼠的认知功能。因此，PI3K／Akt信号通路可能参与抑制凋亡细胞死亡，对大脑神经元增殖起重要作用。

［1］Li ZG，Zhang W，Grunberger G，et al．Hippocampal neuronal apoptosis in type 1diabetes［J］．Brain Res，2002，946（2）：221-231．

［2］王跃春，王子栋，孙黎明，等．动物学习记忆能力的Y-型迷宫测试法［J］．暨南大学学报（自然科学版），2001，22（5）：137-140．

［3］Wuarin L，Namdev R，Burns JG，et al．Brain Insulin-Like growth factor-ⅡmRNA content is reduced in Insulin-dependent and non-Insulin dependent diabetes mellitus［J］．Neurochem，1996，67（2）：742-749．

［4］李红星，赵志炜，王蓉，等．糖尿病大鼠海马神经元存活和凋亡相关蛋白的表达及APP17 肽的作用［J］．中华糖尿病杂志，2004，12（5）：369-372．

［5］代文博，曾亮．PI3K／Akt信号通路与阿尔茨海默病关系的研究进展［J］．现代医药卫生，2014，30（10）：1 549-1 501．

［6］Midyett LK，Rogol AD，Van Meter QL，et al．Recombinant insulin-like growth factor（IGF）-1treatment in short children with low IGF-I levels：first-year results from a randomized clinical trial［J］．J Clin Endocrinol Metab，2010，95（2）：611-619．

［7］迟毓婧，李晶，管又飞，等．PI3K-Akt信号传导通路对糖代谢的调控作用［J］．中国生物化学与分子生物学学报，2010，26（10）：879-885．