肿瘤血管抑制剂DX-1002结构的NMR确证

陈芙蓉，宁 欣，张玉霞，李 丹，林 洁，雍智全，徐小平

（1.四川大学华西药学院，四川 成都 610041；2.东莞达信生物技术有限公司，广东 东莞 523808）

0 引 言

DX-1002 的化学名为（E）-3-（3″-羟基-4″-甲氧苯基）-2-（3′，4′，5′-三甲氧基苯基）丙烯酸正丁铵盐，分子式为：C23H31NO7；分子量为 433.21，是 Compretastatin类化合物的新衍生物，其化学结构如图1所示。

Compretastatin类化合物是Petti小组等从南非Combretum caffrum树干中提取分离的具有抗肿瘤活性的二苯乙烯类化合物[1-3]。与传统的直接作用于癌细胞靶点的细胞毒类化疗药不同，Compretastatin类化合物可靶向作用于肿瘤的血管，引起内皮细胞在形态学上的改变，从而阻塞肿瘤微血管，达到抑制肿瘤的目的[3-9]。目前，同类型的化合物已有CompretastatinA-4P（CA4P）作为前体药物进入临床II-III期试验[2]。然而，这类化合物最大的缺陷是母体结构，即CA4的溶解性极差，虽然经磷酸酯化后以二钠盐的形式增加了水溶性，但是磷酸盐的引入不仅可能带来一定的不良反应，而且降解后的母体溶解性同样低，严重限制了CA4P向其他口服剂型开发的可能，仅能成为静脉注射剂。为此，DX-1002在研发时着重解决了本类化合物的溶解性问题，以溶解性更好的铵盐替代了CA4P的前体结构，不仅药理活性更优且毒副反应更低。由于增加了活性母体的溶解性，使DX-1002化合物适合于制备各种剂型，特别是口服制剂，成为一个极具开发价值的肿瘤血管靶向抑制剂。为了明确本品化学结构，本文拟采用NMR技术检测DX-1002的NMR谱，同时结合本品质谱和红外光谱吸收等特征光谱的验证[10]，首次解析了本品的化学结构。

图1 DX-1002的结构图

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

Varian UNITY INOVA型400核磁共振谱仪（美国瓦里安公司）；布鲁克道尔顿Bio-TOF Q质谱仪（美国布鲁克-道尔顿仪器公司）；意大利CARLO ERBA 1106元素分析仪（意大利）；Nicolet Impact 410型红外光谱仪（美国Nicolet仪器公司）。

1.2 试 剂

氘代水（D2O）：NMR专用试剂。

1.3 样 品

DX-1002精制品的批号为010203，含量≥99.75%（HPLC法），购于东莞安好医药科技有限公司。

2 核磁共振谱

2.1 核磁共振氢谱（1H-NMR）

根据氢谱（见图2），结合gCOSY谱，对样品DX-1002各个氢原子的1H谱进行归属：

1）在1H-MNR谱中，共有11组峰，从低场到高场积分比为 3∶2∶2∶2∶9∶3∶2∶1∶1∶1∶1，DX-1002 分子结构中的27个质子在图谱上体现，4个活泼氢被氘代。

2）δ0.832为一组二重峰，质子数为3，同时gCOSY谱显示，该质子与b-H质子相关，推测为a-CH3；δ1.329为一组二重峰，质子数为2，gCOSY谱显示，该质子除与a-H质子相关外，还与c-H相关，推测为b-CH2；δ1.546为一组二重峰，质子数为2，gCOSY谱显示，该质子与b-H质子和d-H质子相关，推测为c-CH2；δ2.914为一组二重峰，质子数为2，该质子与c-H质子相关，推测为d-CH2。由此，可以推断这4组质子为正丁基上的质子。

3）δ3.593为一组二重峰，质子数为 9，gCOSY 谱显示，该质子与 4″-OCH3和 2′，6′-H 质子相关，推测为 3′，4′，5′-OCH3；δ3.749 为一组二重峰，质子数为 3，gCOSY 谱显示，该质子与 3′，4′，5′-OCH3和 5″-H 质子都相关，推测为4″-OCH3。这两组甲氧基上的质子相互影响，以致在图谱中出现了一个又强又复杂的多峰体系，与DX-1002的化学结构相符。

4）δ6.375为一组单峰，此峰尖锐，质子数为 2，gCOSY 谱显示，该质子与 3′，4′，5′-OCH3质子和6″-H质子相关，推测为 2′，6′-H，与 DX-1002 的结构相符。

图2 DX-1002的1H-NMR谱

5）δ6.386为一组单峰，质子数为 1，gCOSY 谱显示，该质子与3-H质子和6″-H质子具有相关性，推测为 2″-H。

6）δ6.462为一组二重峰，质子数为 1，gCOSY 谱显示该质子与 2′，6′-H 质子和 5″-H 质子相关，推测为 6″-H。 δ6.499为一组二重峰，质子数为 1，gCOSY谱显示，该质子与4″-OCH3质子和6″-H质子相关，推测为 5″-H。δ7.346为一组单峰，质子数为 1，gCOSY谱显示，该质子与2″-H和6″-H相关，推测为3-H。

由上述解析综合可得出DX-1002结构中所有氢原子的归属：δ0.832（d，3H，a-CH3），δ1.329（d，2H，b-CH2），δ1.546（d，2H，c-CH2），δ2.914（d，2H，d-CH2），δ3.593（d，9H，3′，4′，5′-OCH3），δ3.749（d，3H，4″-OCH3），δ6.375（s，2H，2′，6′-H），δ6.386（s，1H，2″-H），δ6.462（d，1H，5″-H），δ6.499（d，1H，6″-H），δ7.346（s，1H，3-H）；另外还有4个活泼氢，在图谱中未能表现出来，在D2O中被D氢取代。该信号归属符合DX-1002的化学结构。

1.2 核磁共振碳谱（13C-NMR）

1）以重水为溶剂测得13C-NMR的图谱（见图3）中，共有21组峰：其中DEPT图谱表现出伯碳有4组共5个碳原子；仲碳有3组共3个碳原子；叔碳有5组共6个碳原子；季碳有8组共为9个碳原子的峰。故样品中共有23个碳原子，这与DX-1002的分子式相符。

2）δ15.103为伯碳峰，且在gHMQC谱上显示与a-CH3的质子近程相关，在gHMBC谱上显示与b-CH3，c-CH3的质子远程相关，故可推定为 a-CH3；δ21.34，δ31.101，δ41.526 均为烷烃仲碳，根据 DX-1002 的结构可推定其分别为 b-CH2，c-CH2，d-CH2。确定这 4 个碳原子构成正丁基（C4H9-）。

3）δ57.788 为伯碳峰，且与 4′-OCH3上的质子近程相关，与4″-OCH3的质子远程相关，推测为4′-OCH3上的伯碳原子；同时δ58.186为二重峰，表示有两个伯碳原子，且与 3′，5′-OCH3的质子近程相关，与 4″-OCH3上的质子远程相关，推测为 3′，5′-OCH3的 2 个伯碳原子；同理，δ63.341为4″-OCH3上的伯碳原子。

4）δ109.224为叔碳峰，峰高且尖，为二重峰，与芳环2′，6′-H上的质子存在近程相关，与3-H的质子远程相关，推定此碳为芳环2′，6′的二个叔碳原子。

5）δ113.626 为叔碳峰，其与 5″-H 位上的质子近程相关，与6′-H上的质子具有远程相关性，推定为5″-C。

6）δ118.900为叔碳峰，与2″-H的质子近程相关，与3-H和6′-H的质子具有远程相关性，推定为2″-C。

7）δ125.518为叔碳峰，与6″-H的质子近程相关，与5″-H的质子存在着远程相关性，推定其为6″-C。

8）δ130.918 为季碳峰，只与 2″，6″-H 的质子存在着远程相关性，推定其为1″-C。

9）δ137.718为叔碳峰，与3-H的质子有近程相关；δ137.812为季碳峰，只有与3-H的质子存在远程相关，推测为C=C上的两个碳原子，即3，2-C。

10）δ138.175为季碳峰，其与多组质子峰存在着远程相关性，故推定为1′-C。

11）δ139.29 为季碳峰，只与 4′-OCH3上的质子存在远程相关性，推测为4′-C。

12）δ146.588 为季碳峰，只与 2″-H 的质子有远程相关性，推测为 3″-C。

13）δ149.858 为季碳峰，只与 5″-H 的质子有远程相关性，推测为 4″-C。

14）δ154.930为季碳双峰，符合这一特性的只有苯环上的 3′，5′-C。

图3 DX-1002的13C-NMR谱

15）δ178.099为季碳峰，没有近程相关的氢，只与3-H质子具有远程相关性，推测为1-C。

综上所述，13C谱的信号归属如下：

δ15.103（a-CH3），δ21.34（b-CH2），δ31.101（c-CH2），δ41.526（d-CH2），δ57.788（4′-OCH3），δ58.186（3′，5′-OCH3），δ63.341（4″-OCH3），δ109.224（2′，6′-C），δ113.626（5″-C），δ118.900（2″-C），δ125.518（6″-C），δ130.918（1″-C），δ137.718（3-C），δ137.812（2-C），δ138.175（1′-C），δ139.29（4′-C），δ146.588（3″-C），δ149.858（4″-C），δ154.930（3′，5′-C），δ178.099（1-C）。

1.3 顺反异构体结构的鉴定

根据本品1H谱、gCOSY、gHQMC和NOESY谱的数据比较和解析，对分子中顺反异构进行了判断。

1）在 gCOSY 谱中可以看到 2′，6′-H 与 6″-H 也具有相关性，证明了 2′，6′-H 与 6″-H 在空间位置上是相接近的，即 2′，6′-H 所在的苯环与 6″-H 所在的苯环在烯烃双键的同侧。

2）由gHMQC谱可知，1-C与3-H具有远程相关性，说明1-C和3-H在烯键的同侧。

3）由 NOESY 谱中可看出，3-H 与 2″-H 和 6″-H具有相关性，说明3-H与2″-H和6″-H在空间位置上很接近，即3-H与2″-H和6″-H所在的苯环连在同一个烯烃碳原子上。

1）2）3 ）的谱图结果显示本结构中的烯键符合反式烯烃（E）的结构特征。

由以上的NMR数据可知，本品与DX-1002的化学结构一致。

2 元素分析

元素分析的结果表明本品H为7.13%，C为60.80%，N为2.86%，与分子式C23H31NO7理论值（C：63.76%，H：7.21%，N：3.23%）相符合。

3 质谱（ESI-MS）

ESI+质谱的质荷比434.16与本品的分子离子峰[M+H]相符；质荷比 361.12 与其[M-NH2（C4H9）+H]的碎片离子相符；质荷比 794.28 为[2M-NH2（C4H9）+H]的碎片峰，质荷比 776.31 为[2M-NH2（C4H9）-OH+H]的碎片峰，由此进一步证明本品分子式为C23H31NO7，分子量为433.21，化学结构与图1的化学结构的一致性。

4 红外吸收光谱（IR）

红外吸收光谱的特征吸收3 516.47，3 384.46，1580.01，1552.05cm-1体现出分子中的胺基的存在，2960.07，2847.16cm-1为甲基，2938.54，2839.19cm-1为亚甲基；3167.50，3066.01cm-1为甲氧基，1233.63，1124.66 cm-1为苯环C-O-C，说明本品中有-OCH3连接在苯环上；1 632.45，1 508.69 cm-1为-C=C-，972.56 cm-1为乙烯基中=CH，904.85，872.63cm-1为苯环上的=CH，说明本品结构中有-C=CH和苯环；1459.37，1355.95cm-1为羧C=O，说明结构中有-COOH。由此，证明本品的结构中存在了-NH2，-CH3，-CH2CH3，-OCH3，苯环，CH=CH，C=O等基团。

5 结束语

综上所诉，根据DX-1002的NMR谱结果，同时结合DX-1002质谱碎片特征、IR光谱特征和元素分析，证明 DX-1002 的化学结构为（E）-3-（3″-羟基-4″-甲氧苯基）-2-（3′，4′，5′-三甲氧基苯基） 丙烯酸正丁铵盐，分子式为C23H31NO7，分子量为433.21。

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