菜粉蝶对十字花科植物挥发物的触角电位反应及引诱剂配方的大田诱捕试验

黄翠虹，游秀峰，王 珏，李为争，闫凤鸣*

(1.顺德职业技术学院医药卫生学院，广东顺德 528333;2.河南农业大学植物保护学院，郑州 450002)

植食性昆虫通过多种感觉器官感知植物或植物花朵的颜色、形状、花式、植物电场和香味，寻找到它们的食物(Clarke et al.，2013)，其中植物的挥发性气味在昆虫对于寄主植物的定向和选择中发挥着关键作用(Visser，1986;Müller and Hilker，2000;闫凤鸣，2011)。在明确昆虫对植物挥发性成分反应的基础上，筛选和鉴定出活性化学成分并开发成诱剂，是害虫安全治理的重要方向，对减少常规化学农药的使用进而防止害虫抗药性发展和保护环境具有重要意义。鳞翅目昆虫幼虫多数是农林生产上的重要害虫，是重点防控的对象，但幼虫扩散能力差，通过挥发性活性成分制成的诱剂进行幼虫种群控制的效果肯定会不理想，而通过调控成虫的取食或产卵行为来抑制下一世代幼虫的种群数量则是一条简捷的思路(Li et al.，2005)。菜粉蝶Pireris rapae 偏好在十字花科植物上产卵，来自甘蓝的多种挥发性成分如绿叶气味(反-2-己烯醛，1-己醇和己醛)、苯乙腈、香叶烯和香叶醇都能激发菜粉蝶的EAG 反应，但对破碎的甘蓝组织或纯的异硫氰酸酯类化合物表现出躲避反应(Anderson et al.，2003)。苯乙醛、芳樟醇和氧代异佛尔酮等化合物还能激发其他鳞翅目昆虫的GC-EAG(van Loon et al.，1992;Omura et al.，1999;Andersson，2003;Andersson，2003a，2003b;李为争等，2003)，可能是引诱蝴蝶进行授粉的主要物质(Andersson and Dobson，2003a，2003b)。由于试验方法和化合物来源的障碍，当前国内外研究多停留在“引诱”、“驱避”等定性的判断上，而从“特征挥发物”(王英慧等，2010)的角度对植物气味成分进行取舍，并确定各成分之间的交互作用的配方设计实验尚未见报道。本研究以菜粉蝶为研究对象，利用经过EAG 测试具有生理活性的11种十字花科挥发性化学物质，采用配方均匀设计法(李云雁和胡传荣，2009)，组配了一系列混合物，进行了连续3年的野外诱捕试验，旨在为菜粉蝶的化学生态调控提供具有实用价值的引诱剂。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

本研究室内试验在河南农业大学化学生态实验室进行;大田诱捕试验于2009年6月10 日到7月10 日、2009年7月17 日到8月14 日、2010年9月1 日到10月23 日、2011年5月1 日到6月23 日在河南农业大学科教园区进行。

1.2 试验材料

1.2.1 供试昆虫

于2008年从河南农业大学科教园区甘蓝田采集菜青虫幼虫，用甘蓝叶在15 L∶9 D(暗期为23∶00-次日8∶00)、二级变温(光期30℃±2℃、暗期28℃±2℃)、RH 70%的人工气候箱中饲养，羽化后的成虫饲以10%(v/v)蔗糖水。

1.2.2 供试试剂

根据现有文献报导能引起菜粉蝶及鳞翅目昆虫EAG 反应(van Loon et al.，1992;Omura et al.，1999;Andersson，2003;Andersson，2003a，2003b;Andersson and Dobson，2003a，2003b;李为争等，2003;王英慧等，2010)的植物气味中选取11种十字花科植物含有的挥发性化合物作为供试试剂，其英文名称和缩写见表1。其中正己醇(EAG 参照物)、苯甲醇、苯乙酮购买于北京化学试剂公司;水杨酸甲酯、乙酸苯甲酯、苯乙醇购买于中国医药集团(上海)化学试剂有限公司;香叶醇购于Fluka 化学试剂公司;丁香酚、肉桂醛和水杨醛购于上海双喜香料助剂厂;苯甲醛和苯乙醛购于Sigma-Aldrich 化学试剂公司，纯度95%-99%。

1.3 试验方法

1.3.1 触角电位反应测试

供试化合物除了乙醇外，其他化合物用石蜡油(天津科密欧公司)稀释100 倍，正己醇用石蜡油稀释相同的比例用作参照，溶剂石蜡油用作对照。分别测定菜粉蝶处女雄蝶、处女雌蝶的触角电位。将触角从基部切下，同时切去尖端少数几节，放在记录电极和参比电极之间，电极缓冲液为Kaissling 溶液(Li et al.，2005)。玻璃毛细管电极内插Ag-AgCl 电极，与前置放大器(Syntech AC/DC UN-06)连接。放大的信号采用EAG 2000(Syntech)进行记录并输出到电脑。刺激物和湿润的洁净气流(20 mL/s)通过两个独立管道吹送到离体触角上，由刺激气流控制器(Syntech CS-05)控制，供试样品剂量为20μL，滴加在6 cm×0.5 cm 的滤纸条上，离触角的距离为1 cm，刺激持续期为0.02 s，首先用参照和对照依次刺激，然后随机抽取样品进行刺激，完成一次循环之后仍然按该步骤进行，一根触角可以做3-4个这样的循环。刺激间隔期为30 s。每个样品重复测定11 次。

1.3.2 诱芯配方设计

配方均匀设计是利用矩阵理论，只考虑试验点在超体积空间均衡散布的试验设计方法，试验次数和因素水平数相等，利用多元回归方法逐步剔除无关因素，获得高效、简易的配方(李云雁和胡传荣，2009)。本试验根据文献中的配方均匀设计表(李云雁和胡传荣，2009)，共制备了4 组配方，第1 组配方采用UM*12(127)对7种十字花科常见挥发性化合物苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯甲酯、β-苯乙醇、肉桂醛、丁香酚和水杨酸甲酯进行诱捕活性考察;第2 组配方剔除苯甲醛和苯甲醇，采用UM*10(105)考察其他5种成分组成的10个配方的引诱活性;第3 组配方采用UM*10(105)考察水杨醛、乙酸苯甲酯、苯乙醛、香叶醇和苯乙酮5种成分的诱捕贡献，第4 组配方在第3 组配方的基础上去掉香叶醇和苯乙酮。配方中供试挥发物总剂量均为1000μL，各化合物按比例添加到8 mL 玻璃瓶中混匀，然后用2%琼脂胶包结(Li et al.，2005)，置于4℃冰箱中备用。

1.3.3 大田诱捕实验

大田实验连续进行了3年，一共进行了4 次，每个时期每个配方均重复3 次，由于每个试验阶段田间气温差别较大，导致诱芯持效期不同，为了具有各阶段的横向可比性，表2 中已经折算为每日释放量(μL)。由于蝶类的视觉非常发达，在远距离定向蜜源寄主时发挥着首要作用，尤其偏好亮黄色和蓝色(Honda et al.，1998;Omura et al.，1999;Andersson，2003b)。为了避免这些偏好颜色对花香挥发物诱捕结果的影响，试验采用市售的口径24 cm 的不锈钢水盆作为诱捕器，诱芯离水面的高度为1-3 cm，水盆中加满水和少量洗衣粉，使得菜粉蝶的鳞片容易被浸润，诱芯悬挂在田间直到每个试验期结束为止。试验水盆在田间竹竿三脚架上的悬挂高度为1.5 m，诱捕器间距为25 m，每个盆上用打价纸标签编上编号贴在水盆侧面便于识别和防止雨淋。采用完全随机化区组设计，即分为3个试验小区，每个小区中各个配方均出现1 次，在区组内部则各个配方所在的诱捕器位置完全随机化，每隔2-3 d 调查记录一次所有诱捕器中的菜粉蝶数量，每次调查完各区组内部诱捕器的位置重新随机化排列一次。

1.3.4 数据分析

实验数据采用Microsoft Excel 和SAS 进行统计分析，具体分析方法如下:

触角电位反应测试:首先用两次参照之间的数值计算各个样品和对照的矫正EAG 反应值，计算方法是将相邻两次参照的差值计算:

其中，refi和refi+1表示相邻两次参照的实际EAG 反应值，Trk为前一次参照刺激之后第K个刺激物的实际EAG 反应值，CK 为按照上述方法校正后的反应值，“12”表示两次参照之间一共有12个样品(包含对照)。然后采用单因素方差分析和Duncan's 多重比较法处理数据。

大田诱捕实验:除了第4 组配方外，其他各个时期野外的菜粉蝶诱捕量均较少，因此将不同时期、不同重复的相同配方的诱捕数据合并处理，采用多元线性回归方法判断各种花香挥发物不同释放量对菜粉蝶诱捕量影响的相对顺序。针对有显著影响的成分，将诱捕量数据与其剂量作图，获得回归方程和相关系数。

2 结果与分析

2.1 菜粉蝶对花香气味的触角电位反应

菜粉蝶成虫对不同花香气味挥发物的相对EAG 反应结果如图1 所示。从中可以看出，没有任何一种花香气味激发的EAG 反应比用作参照的正己醇(一种绿叶气味)更强。

表1 菜粉蝶成虫对测试的花香挥发物的EAG 反应及这些化合物的基本理化特性Table 1 Relative EAG values of Pireris rapae adults in response to different floral scents

2.2 大田诱捕试验结果

采用配方均匀设计组合了4 组配方，于3个年份进行了野外诱捕试验，结果汇总于表2-3，各时期配方中每日释放量与菜粉蝶诱捕量较相关的成分的回归分析结果见图1 a-f。花香成分中最常见的芳香族化合物苯乙醛和苯乙醇在其供试的配方中的含量与相应时期的菜粉蝶累计诱捕量恒表现为线性正相关关系，其中苯乙醛的活性更强。然而，在2011年的诱捕中，苯乙醛每日释放量在15μL 以下的配方菜粉蝶累计诱捕量非常低而且相近，而苯乙醛含量最大的配方(表3，2011年5月1 日-2011年6月23 日，配方编号1)诱捕量有了突然的增加，说明菜粉蝶对苯乙醛存在最低反应阈值。水杨酸甲酯在2009年6月10 日-7月10 日的诱捕试验中具有明显引诱活性，但在2009年7月17 日-8月14 日的诱捕中与菜粉蝶诱捕量的关系不很明显，其原因有待进一步探明。此外，苯甲醛和苯甲醇两种物质据室内试验报道(Andersson and Dobson，2003b)能够激发菜粉蝶较强的喙伸展反应，在野外诱捕结果中对这两种化合物的在诱芯中的含量和菜粉蝶的诱捕量进行回归统计显示无显著相关性。

表2 2009年使用的配方及各配方对菜粉蝶的累计诱捕量Table 2 Candidate lures used in 2009 and their cumulative trap catches of Pireris rapae

表3 2010年和2011年使用的配方及各配方对菜粉蝶的累计诱捕量Table 3 Blends used in 2010 and 2011 and their trap catches of Pireris rapae adults

续上表

3 结论与讨论

本研究测试了菜粉蝶对常见花香气味的EAG反应并进行了大田诱捕，在室内触角电位反应较强的乙酸苯甲酯和香叶醇，以及此前报道能引起菜粉蝶喙伸展反应的苯甲醛、苯甲醇等物质均是在大田诱捕中无效，而苯乙醛、苯乙醇和水杨酸甲酯在野外具有引诱菜粉蝶的作用。这种EAG 反应结果与行为反应不一致的现象此前也有许多报道(Honda et al.，1998;Omura et al.，2000;Andersson，2003)。

菜粉蝶成虫对用作参照的正己醇(一种绿叶气味)的EAG 反应超过任何一种花香气味物质，这可能意味着菜粉蝶在长期进化过程中首先应当学会寻找“绿色植物”，在这个前提下才能考虑其他因素，当然也可能与该化合物分子量最小、沸点最低有关。昆虫对植物气味的反应不如信息素那样专一和灵敏，各种植物挥发性化合物以不同浓度和配比能够引发不同的行为反应，用均匀配方设计方法对常见的十字花科植物气味进行筛选，寻求诱导菜粉蝶的最佳配方在控制菜粉蝶危害上有重要的应用意义。苯甲醛和苯甲醇两种物质据室内试验报道(Omura et al.，1999)能够激发菜粉蝶较强的喙伸展反应，在本实验的大田诱捕结果中对这两种化合物在诱芯中的含量和菜粉蝶的诱捕量进行回归统计显示无显著相关性而苯乙醛和水杨酸甲酯诱捕效果较好。

苯乙醛、苯乙醇为最常见的花香化合物，这说明菜粉蝶可能对各种植物的花香气味没有明显的选择性。苯乙醛作为最关键的花香成分也能引诱许多鳞翅目的蛾类。花香气味苯乙醛对棉铃虫Heliocoverpa armigera、亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 等多种蛾类具有引诱作用(Cunningham et al.，2006);茉莉花Cestrum nocturnum 所产生的挥发物对粉纹夜蛾Trichoplusia ni 有明显的引诱作用，而且粉纹夜蛾晚上的取食时间与茉莉花产生香味的时间相一致，起取食引诱作用的主要成份为苯乙醛(Heath et al.，1992)。研究发现苯乙醛和α-蒎烯能够诱导棉铃虫蛾的取食行为，苯乙醛和芳樟醇联用能增强对棉铃虫蛾的引诱力(Cunningham et al.，2004，2006;Meagher and Landdolt，2010);花中的一些典型化合物如丁香醛的异构体、反-β-罗勒烯以及芳香族化合物如苯甲醛、苯乙醛或藜芦醚(邻二甲氧基苯)对许多夜出性鳞翅目昆虫具有引诱活性(Dötter et al.，2005);苯乙醛、乙酸苯甲酯和苯甲醛组成的配方比单用苯甲醛或空白诱捕器捕获到更多的大豆夜蛾(Meagher，2002)。

图1 配方中3种关键成分不同释放速率对菜粉蝶诱捕量的影响Fig.1 Effect of different doses of three key components on the trap catch of Pireris rapae adults

Andersson 等(2003)采用13C 标记方法研究了菜粉蝶雌雄交尾过程中的物质传递，发现水杨酸甲酯和吲哚是交尾过程中由雄虫传递到雌虫体内的2种抗欲(anti aphrodisiac)活性的物质，能够降低交配后的雌蝶对其他雄性个体的引诱力，从而缓和精子竞争现象。这可能是由于水杨酸甲酯仅在与雌性信息素混合时才能起到抑制后者引诱活性的作用，或者与另一化合物吲哚混合时才能起作用，而独立存在的水杨酸甲酯可能代表了一种花香气味而不是“雄性的气味”。在许多夜蛾类雄虫的味刷中，也存在着各种花香气味，例如甘蓝夜蛾Mamestra brassicae 味刷中存在苯甲醇和苯乙醇，白肾灰夜蛾Polia persicariac 味刷中存在苯甲醇、苯乙醇和苯乙醛，蓓带夜蛾 Mamestra configurata 的味刷成分是苯乙醇，灰夜蛾的味刷成分是苯甲醛、苯甲醇和苯乙醇。这些气味可能具有引诱取食、雌雄近距离相遇后促进交尾、阻止其他雄蛾接近等功能(王荫长，2004)。由于本试验除了2011年各配方诱捕量较大，其他时期诱捕量较小，故未进一步分性比进行统计。

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