液相色谱-质谱联用法测定乳品中维生素D3质量浓度

谢玉珊，谢守新，宋阳，金梦,王金花，李小林，梁庭炜，林海丹，邹志飞

（1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广州510623；2.北京出入境检验检疫局技术中心,北京100026）

0 引言

维生素D是一种脂溶性维生素，目前已知的维生素D至少有10种，但最重要的是维生素D2和维生素D3。维生素D对健康的意义被广泛的认知。我国GB 14880-2012[1]将其列为营养强化剂,乳品中通常只添加维生素D3。

目前，国内外维生素D检测的传统方法是液相色谱法，如我国国家标准方法[2]。近年来，选择性强、灵敏度高的液相色谱-质谱法[3]已有应用于维生素D检测的报道。液相色谱-质谱法检测的选择性好，灵敏度高，操作简便，较好满足含量低的婴幼儿乳品中维生素D的测定。

本研究采用液相色谱串联质谱法对婴幼儿乳品中维生素D3测定进行研究，采用同位素内标法，同时优化了样品的前处理。方法简便，准确。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（HPLC级），正己烷，乙醇，无水硫酸钠，氯化钠，氢氧化钾，抗坏血酸，维生素D3，氘代维生素D3标准品（Vitamin D3-2[H]2），纯度≥99%）。

维生素D3标准储备液（质量浓度100 μg/mL）：精密称取10 mg（精确至0.1 mg）维生素D3，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。

氘代维生素D3标准储备液（质量浓度500 μg/mL）：精密称取5 mg（精确至0.1 mg）氘代维生素D3标准品，用乙醇溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中。

氘代维生素D3标准工作液（质量浓度1.00 μg/mL）：量取0.100 mL的氘代维生素D3标准储备液（500 μg/mL），用乙醇定容至50 mL。

1.2 仪器与设备

AB 4000QTRAP串联质谱仪，岛津液相色谱仪(四元低压梯度输液泵,自动进样器,柱温箱)，电喷雾离子源，Valco二位流路切换阀，AB公司Analyst仪器控制及数据处理软件，分析天平，水浴振荡器，Sigma 3-16PK离心机，IKA MS 3涡旋振荡器，Mill-Q超纯水器，氮吹仪，分液漏斗，三角锥瓶，比色管，吹氮管。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取5 g（精确至0.01 g）试样于250 mL三角瓶中，加入1 g维生素C，用45～50℃的水使其溶解，再加入30 mL乙醇、15 mL质量分数为50%氢氧化钾溶液，混合均匀后充氮，盖上瓶盖，置于85℃水浴振荡中皂化40～50 min，取出立即水流冷却至室温。

用少量饱和氯化钠溶液将上述皂化液全部转入250 mL分液漏斗中，加入40 mL正己烷，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，剧烈振荡提取，静置分层，收集正己烷层，按上述方法用正己烷30 mL×2次萃取提取，合并正己烷溶液并用饱和氯化钠溶液洗至近中性，收集正己烷层定容至100 mL，加入无水硫酸钠振摇脱水，量取5.00 mL，加入100 μL氘代维生素D3标准工作液，于45℃氮气吹干，乙腈定容至1 mL，涡旋混匀，经0.45 μm有机相滤膜过滤后，供液相色谱质谱测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为YMC C18柱（50 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相为甲醇(A)-5 mmol/L甲酸铵(B)，0～4 min,A为85%～100%；4～7 min,A为100%；7.01～10 min,A为85%；流速为0.35 mL/min；柱温为40℃；进样量为10 μL。

1.3.3 质谱条件

2 结果与讨论

表1 正TurboIonspray电离源（ESI）的各参数

表2 多反应选择离子监测方式(MRM)的各参数

2.1 样品前处理方法的优化

乳品中维生素D是脂溶性的，经典方法采用乙醇-氢氧化钾溶液皂化，本方法改进了国标法，方法更加简便实用。改进如下：减少称样量，原来10 g，修改为5 g，原方法加抗坏血酸乙醇溶液，改为直接加固体抗坏血酸，减少体系的溶剂体积，这样有利于下一步于振荡器中振摇皂化时振动充分，且不会溅出。振荡皂化时使用的三角锥瓶的瓶塞的气密性很重要，改用了聚四氟乙烯瓶塞，确保振摇皂化时瓶塞不会松脱，避免了空气带入造成维生素的氧化损失，从而使回收率稳定。本方法提高了皂化温度，实验表明温度提高至85℃，不影响维生素D3回收率，而油脂皂化更加彻底，有利于下一步的萃取净化和仪器分析。改用正己烷替代石油醚，使萃取分层更加明显，减少乳化。采用氮气吹干部分萃取液，因为液相色谱质谱法灵敏度比原国标法液相色谱法高许多，因此只需采用部分萃取液吹干后，定容分析已满足检测要求，既减少试剂损耗又缩短实验时间。在吹干前加入内标物，既校正了氮气吹扫时维生素的损失又能有效校正质谱分析时的基质效应。

2.2 质谱条件的优化

蠕动泵以10 μL/min的流速连续注射质量浓度为0.1 mg/L的维生素D3标准溶液入TurboIonspray电离源中，在正离子检测方式下对维生素D3进行一级质谱分析（Q1扫描），得到分子离子峰，对各准分子离子峰进行二级质谱分析（子离子扫描），得到碎片离子信息，维生素D3二级质谱见图1。由此确定定性用的各离子对。采用MRM模式采集数据，选择驻留时间为100 ms,优化各离子对的去簇电压（DP），碰撞气能量（CE），入口电压(EP)，碰撞池出口电压(CXP)。

采用“T”三通方式，即蠕动泵以10 μL/min的流速连续注射0.1mg/L的维生素D3标准溶液，流动相则以350 μL/min的流速与维生素D3标准溶液混合后进入离子源来进行优化色谱流动相合离子源气体的各参数。当分别用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-5 mmol/L甲酸铵，甲酸铵的相应值相对较高，采用乙腈代替甲醇，相应值没有明显变化。因此选用甲醇-5 mmol/L甲酸铵作为流动相，

灵敏度足以满足要求。

图1 维生素D3的子离子全扫描色谱

2.3 色谱条件的优化

经质谱条件筛选后选用甲醇-5 mmol/L甲酸铵溶液作为流动相，考察其色谱行为，维生素D3的峰形理想，对样液进行分析，试验梯度洗脱条件，确定最佳的洗脱梯度，标准和样品的维生素D3及其内标的多反应监测离子图如图2所示。

图2 标准和样品的维生素D3及其内标的MRM（多反应监测离子图）

2.4 线性范围

用乙腈配成的一系列质量浓度的标准混合工作溶液按实验的仪器条件进行测定，以分析物与内标物峰面积比(Y)-分析物与内标物质量浓度比(X)作校正曲线，得到线性回归方程y=1.55×104x+7.83×103，维生素D3在0～50 μg/L范围内线性关系良好（相关系数为0.9999），相关系数均大于0.99，结果如表3所示。

2.5 回收率、精密度及定量限

采用本方法在婴幼儿奶粉中添加维生素D3标准溶液，按方法进行回收率实验，每个添加浓度重复测定6次，计算添加平均回收率和相对标准偏差，结果见表3。奶粉中维生素D3的平均回收率在83.9%～93.0%之间,变异系数为1.10%～4.90%,方法的准确度和精密度均符合残留分析要求。实验表明样品中维生素D3在添加20 μg/kg水平时，信噪比（S/N）大于10，且回收率和精密度满意，因此以20 μg/kg作为方法的定量限。

表3 奶粉中维生素D3的添加回收率和精密度(n=6)

2.6 实际样品分析

采用本方法对经多个实验室比对标定维生素D3的奶粉质控样品进行测定，重复测定6次，平均测定值为82.1 μg/kg，变异系数为5.10%，结果在质控的警戒控制线（72.3～97.0 μg/kg）内。

3 结束语

本方法研究建立了乳品中维生素D3的高效液相色谱质谱联用法。方法的样品的前处理简单、易操作、定量准确，适用于乳品中维生素D3的检测。与国标法比较，仪器的灵敏度提高了，不需采用半制备色谱的方法可以达到检测的要求，减少试剂的消耗和缩短了检测时间，同时质谱法的定性的准确性高。与其它同类方法比，采用同位素内标定量，有效降低基质效应，定量更为准确。

[1]GB 14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》[S].

[2]GB 5413.9-2010婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定[S]

[3]黄芳,吴惠勤,杭义萍.高效液相色谱-串联质谱法测定食品中维生素D2 和维生素D3[J].理化检验：化学分册，2011，47（5），577-579，582.