探讨微小核糖核酸-455在压力超负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型中的作用机制

吴春涛，李拥军，刘苏，王智勇

探讨微小核糖核酸-455在压力超负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型中的作用机制

吴春涛，李拥军，刘苏，王智勇

目的：通过结扎小鼠主动脉弓导致主动脉缩窄（TAC）两周后建立心肌肥厚的模型，旨在探讨微小核糖核酸-455（miR-455）在心肌肥厚中细胞与分子学机制。

方法：选用18只昆明种小鼠，随机分为TAC+miR-455组（n=6，尾静脉注射包被miR-455 的腺病毒）、TAC+绿色荧光蛋白（GFP）组（n=6，TAC+GFP组，尾静脉注射包被GFP的腺病毒）和假手术组（n=6，尾静脉注射包被GFP的腺病毒）。术后两周测量小鼠血流动力学及超声心动图指标；对心肌组织进行苏木素-伊红（HE）染色和马松（MASSON） 染色观察心肌组织病理学变化；应用荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测心肌肥厚基因与纤维化基因的表达；免疫蛋白印迹法（Western blot）分析凋亡蛋白；qRT-PCR与Western blot分析miR-455的靶基因和蛋白。

结果：造模两周时，与假手术组比较，TAC+GFP组小鼠心重/体重值增加[（9.78±0.20） mg/g vs（8.25±0.22） mg/g，P＜0.01]，左心室舒张期前壁厚度明显增加[（1.782±0.058） mm vs （1.457±0.050） mm，P＜0.05]，左心室舒张期内径变小[（3.027±0.052）mm vs （3.142±0.050）mm，P＜0.05]，左心室射血分数增加[（84.167 ±4.167）% vs（77.000±3.347）%，P＜0.05]；心肌肥厚基因（心房钠尿因子、骨骼肌肌动蛋白和β肌球蛋白重链）和心肌纤维化基因（转化生长因子β1和结缔组织生长因子）表达的明显增加（P均＜0.05）；抗凋亡蛋白有明显降低，促凋亡蛋白明显升高（P均＜0.05）。与TAC+GFP组比较，TAC+miR-455组小鼠的心重/体重值增加[（12.04±0.11）mg/g vs （9.78±0.20）mg/g，P＜0.01]，左心室舒张期前壁厚度增加[（1.908±0.062） mm vs （1.782±0.058）mm，P＜0.01]，左心室舒张期内径变小 [（2.893±0.069）mm vs（3.027±0.052） mm，P＜0.01]，但两组在左心室射血分数方面差异无统计学意义（P＞0.05）；心肌肥厚基因表达增加（P均＜0.05），但心肌纤维化基因表达水平两组差异无统计学意义（P＞0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2虽降低但差异无统计学意义（P＞0.05），促凋亡蛋白Bax无明显升高。Western blot 分析，TAC+GFP组与假手术组比较，钙网蛋白（CALR）和葡萄糖调节蛋白78 （GRP78）蛋白水平都有升高（P均＜0.01），TAC+miR-455组与TAC+GFP组比较，GRP78水平差异无统计学意义（P＞0.05），而CALR水平却有了明显下降（P＜0.01）；qRT-PCR结果显示CALR水平下降同时也有CALR mRNA的下降（P＜0.01）。

结论：短期压力负荷后小鼠出现了代偿性心肌肥厚的特征，表现为心室壁的增厚，心室腔的缩小，心重/体重比值增加以及心脏收缩功能的增强；病理学出现明显心肌细胞增大，伴随出现心肌肥厚相关的胎儿期基因的重新激活。miR-455通过降解靶mRNA使CALR降低这条途径，使得心肌细胞进一步增大，心肌肥厚更加明显。

微小核糖核酸；心肌肥厚；钙网蛋白

Methods: The mice model of cardiac hypertrophy was established by transverse aorta constriction (TAC), and 18 male kunming TAC mice were randomly divided into 3 groups:①TAC + miR-455 group,②TAC + GFP (green fluorescence protein)

group and ③Sham group (sham operation + GFP). n=6 in each group and all animals were treated for 2 weeks. The hemodynamic and echocardiographic indexes were examined, histo-pathological changes of myocardial tissue were observed by HE and Masson staining. The hypertrophic and fibrosis gene expressions were measured by RT-PCR, the apoptosis protein level was detected by Western blot analysis. The expressions of miR-455 targeting gene and protein were also determined.

Results: Upon 2 weeks modeling, compared with Sham group, TAC+GFP group had increased ratio of heart weight/ body weight (9.78 ± 0.20) mg/g vs (8.25 ± 0.22) mg/g, P＜0.01, increased left ventricular diastolic (LVD) wall thicknesses (1.782 ± 0.058) mm vs (1.457 ± 0.050) mm, P＜0.05, decreased LVD diameter (3.027 ± 0.052) mm vs (3.142±0.050) mm, P＜0.05, increased LVEF (84.167 ± 4.167) % vs (77.000 ± 3.347) %, P＜0.05; increased gene expressions of cardiac hypertrophy and fibrosis, all P＜0.05, decreased anti-apoptosis protein and increased promoting apoptosis protein, all P＜0.05. Compared with TAC+GFP group, TAC+miR-455 group presented increased ratio of heart weight/body weight (12.04 ± 0.11) mg/g vs (9.78 ± 0.20) mg/g, P＜0.01, increased LVD wall thicknesses (1.908 ± 0.062) mm vs (1.782 ± 0.058) mm, P＜0.01, decreased LVD diameter (2.893 ± 0.069) mm vs (3.027 ± 0.052) mm, P＜0.01, while LVEF was similar between 2 groups, P＞0.05; increased gene expression of cardiac hypertrophy, P＜0.05, while gene expression of cardiac fibrosis was similar between 2 groups, P＞0.05; the anti-apoptosis protein and promoting apoptosis protein expressions were similar between 2 groups. Compared with Sham group, TAC+GFP group had increased expressions of calreticulin (CALR) and glucose-regulated protein 78 (GRP78), all P＜0.01. Compared with TAC+GFP group, TAC+miR-455 group had decreased mRNA and protein expressions of CALR, both P＜0.01, while GRP78 protein expression was similar between 2 groups, P＞0.05.

Conclusion: miR-455 may promote cardiac hypertrophy induced by short-term overload pressure via targeting CALR in experimental mice.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:889.)

近年来在多种生命体内发现了一种新的小分子核糖核酸（RNA），即微小核糖核酸（miRNA）。miRNA是一类由内源基因编码的15～22 bp的非编码单链RNA分子，通过结合靶基因mRNA的3'非编码区而对其表达进行转录后表达调控[1]。最近发现miRNA通过转录后负性调节目的蛋白质参与许多心血管病，例如miRNA-34a、miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-133、miRNA-208/miRNA-195和miRNA-199与心肌肥厚有关[2-5]，miRNA-29 和miRNA-21与心肌纤维化有关[6,7]，miRNA-210 和miRNA-494与缺血性心脏病有关[8,9]。事实上关于微小核糖核酸-455（miR-455）的研究很少，PubMed 上仅有4篇关于miR-455的文章[10-13]，而且其中并没有miR-455与心肌肥厚的研究。通过计算机计算miR-455 的5'端有6个核苷酸，被称为种子序列（Seed sequence），与钙网蛋白（CALR）匹配完好（图1），而CALR与心肌肥厚关系密切，因此可以大胆推测miR-455在心肌肥厚中起着重要作用。我们通过小鼠结扎主动脉弓导致主动脉缩窄（TAC））建立了心肌肥厚的模型，旨在探讨miR-455在心肌肥厚中的细胞与分子学机制。

图1 miR-455与钙网蛋白的碱基互补

1 材料与方法

实验动物与分组：选用18只4周龄健康雄性昆明种小鼠（购自河北医科大学），体重约（20±2）g，随机分为主动脉缩窄（TAC）+miR-455组（TAC+miR-455组），TAC+绿色荧光蛋白（GFP）组（TAC+GFP组）和假手术组，每组6只。TAC+miR-455组小鼠于主动脉弓结扎术后第1天，第8天尾静脉注射包被miR-455 的腺病毒0.1 ml（5.0×109ifu/ml，Invitrogen，中国上海）；TAC+GFP组小鼠于主动脉弓结扎术后第1天，第8天尾静脉注射包被GFP的腺病毒0.1 ml（1.0×109ifu/ml，Invitrogen，中国上海） ；假手术组小鼠于手术后第1天，第8天尾静脉注射包被GFP的腺病毒0.1 ml（1.0×109ifu/ml，Invitrogen，中国上海）。

动物模型制作：小鼠麻醉后找到左胸骨边缘约2 mm处，沿第二肋间隙打开胸腔，游离主动脉弓，于锁骨下动脉（第一分支）和左颈总动脉（第二分支）间穿0号线备用，平行于主动脉弓放置27-gauge（直径0.4 mm）针头，一同结扎后抽出针头，使主动脉狭窄65%～70%。假手术组手术同上，但不结扎主动脉弓。

超声心动图检查：应用超声心动图于手术前、术后2周评估心功能。测量左心室舒张期内径

（LVIDd）、左心室舒张期前壁厚度（LVAWd）、左心室射血分数（LVEF）。

血流动力学检测：术前、术后2周三组小鼠行微导管术进行血流动力学检测，测量并记录动脉收缩压、左心室收缩末压（LVESP）、左心室舒张末压（LVEDP）。

病理组织学检测：血流动力学测定之后，迅速取出心脏，放入冰生理盐水后泵出心腔余血，滤纸吸干水分精密天平称重，计算心重/体重值（mg/ g）。取心室肌，置于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脱水，石蜡切片，进行苏木素-伊红（HE）染色和马松（MASSON） 染色，应用Motic 6.0分析软件（中国厦门）显微镜下观察。

心肌组织miR-455、mRNA的测定：Trizol法提取总RNA，使用Applied Biosystems 7300型PCR基因扩增仪进行荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。miR-455以U6为内参（All-in-One miRNA qPCR Detection System，GeneCopoeia，马里兰州，美国），miR-455 引物序列：ATGTGCCTTTGGACTACATCGAA；U6引物序列：TCGTGAAGCGTTCCATATTTTTAA；通用下游引物：TTACTACGTCATGACTAGTAA。mRNA以β-肌动蛋白（β-actin）为内参（赛百盛，中国北京），采用ΔCt（ΔCt目的-ΔCt内参）法进行相对定量分析，以2-ΔCt作为目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列表

免疫蛋白印迹法分析：提取心肌细胞总蛋白，用Lowry蛋白定量试剂盒测定蛋白含量[14]，用5X样品Buffer处理后分装-70℃贮存。取上述细胞蛋白样品（含蛋白75 μg）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，10%分离胶），将电泳分离后的蛋白质电转移至PVDF膜上（Millipore Immobion-P，Millipore，马塞诸塞州，美国），经封闭、洗脱后分别加入抗CALR：1:500；抗Bax：1:500；抗Bcl-2：1:1000（博士德，中国武汉）4℃孵育过夜，洗膜后以相应荧光二抗孵育1 h，并以兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（1:5000，BioWorld，中国南京）同上操作，作为内对照。抗原—抗体复合物用双色红外激光扫描仪进行扫膜采用Image-Pro Plus（Version 4.1，Media Cybernetics，LP，美国）软件分析蛋白条带积分光密度值（IOD），以靶蛋白IOD 与GAPDH 的IOD比值反映靶蛋白相对表达水平。

统计学处理：采用SPSS 19.0统计分析软件进行分析。实验数据用均数±标准差表示，组间及组内比较用方差分析（ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-455在小鼠体内的转染（图2）

造模2周后，与假手术组相比，TAC+GFP组小鼠体内miR-455表达明显降低。与TAC+GFP组相比，TAC+miR-455组小鼠体内miR-455表达明显升高（P均＜0.01），说明miR-455在小鼠体内转染成功。

图2 小鼠心肌组织miR-455的表达

2.2 miR-455对小鼠血流动力学、超声心动图参数、心肌肥厚和心肌纤维化基因及心肌组织病理学的影响（表2）

造模2周后，与假手术组相比，右侧颈动脉血压测定显示，TAC+GFP组和TAC+miR-455组小鼠动脉收缩压和LVESP明显升高（P均＜0.01），但是

LVEDP差异无统计学意义（P均＞0.05），说明小鼠高血压模型成功，正处于高血压后心肌肥厚状态，未进入心力衰竭。

与假手术组相比，TAC+GFP组小鼠的心重/体重值增加（P＜0.01），LVAWd明显增加，LVIDd变小，LVEF增加（P均＜0.05）。TAC+miR-455组较TAC+GFP组心重/体重值增加（P＜0.01），LVAWd增加，LVIDd减小（P均＜0.01）。TAC+miR-455组较TAC+GFP组LVEF增加， 但差异无统计学意义（P＞0.05）。

miR-455对心肌肥厚基因表达的影响：造模两周时，与假手术组比较，TAC+GFP组小鼠心肌组织中心房钠尿因子、骨骼肌肌动蛋白和β肌球蛋白重链基因表达有明显增加（P均＜0.01）。与TAC+GFP组比较，TAC+miR-455组心房钠尿因子、骨骼肌肌动蛋白和β肌球蛋白重链的基因表达有进一步增加（P均＜0.05）。

miR-455对心肌纤维化基因表达的影响：与假手术组比较，转化生长因子β1（TGFβ1）和结缔组织生长因子（CTGF）在TAC+GFP组和TAC+miR-455组的表达都有明显上升（P均＜0.05），但两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。说明TAC 2周时心肌纤维化已开始出现，但miR-455对纤维化的影响未明显显现出来。

造模2周时，心室壁HE染色显示，假手术组可见心室壁厚度正常，TAC+GFP组心室壁厚度增厚，TAC+miR-455组较TAC+GFP组心室壁厚度进一步增厚。心肌细胞HE染色显示，假手术组可见心肌细胞呈红色，心肌细胞排列整齐，大小正常，胞浆均匀，胞核染色均匀。TAC+GFP组心肌细胞横截面积增大。TAC+miR-455组较TAC+GFP组心肌细胞进一步增大，心肌细胞排列紊乱，细胞浆浓染，细胞间距增大，细胞核空染增多。心肌纤维MASSON染色显示，假手术组可见少量胶原纤维散在分布于心肌细胞间隙中，呈现蓝色，较之于假手术组，TAC+GFP组和TAC+miR-455组心肌胶原纤维明显增加（图3）。

表2 三组小鼠血流动力学、超声心动图参数及心肌肥厚基因和心肌纤维化基因的表达比较

表2 三组小鼠血流动力学、超声心动图参数及心肌肥厚基因和心肌纤维化基因的表达比较

注：1 mmHg=0.133 kPa。与假手术组比*P＜0.05**P＜0.01；与TAC+GFP组比△P＜0.05△△P＜0.01。余注见图2

?

图3 心肌HE及MASSON染色结果

miR-455 对心肌细胞凋亡的影响（图4）：Western blot 示造模两周时，与假手术组相比，TAC+GFP组促凋亡蛋白Bax水平有明显上升（P＜0.05），TAC+miR-455组变化不明显（P＞0.05）。对于抗凋亡蛋白Bcl-2，与假手术组比较，TAC+GFP组和TAC+miR-455组有所下降（P＜0.01），但后两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

miR-455的靶基因分析（图5）：Western blot 分

析，TAC+GFP组小鼠心肌CALR和GRP78蛋白水平升高（P均＜0.01），但经过了miR-455的干扰，TAC+miR-455组GRP78水平依然升高（P＜0.01），而CALR水平却有了明显下降（P＜0.01），说明CALR是miR-455的靶蛋白之一。qRT-PCR提示CALR水平下降同时也有小鼠心肌CALR mRNA的表达下降，说明miR-455对CALR的调节是通过降解mRNA来抑制蛋白翻译。

图4 免疫蛋白印迹法分析小鼠心肌组织凋亡蛋白表达

3 讨论

在实验中，首先利用TAC成功构建了压力超负荷致小鼠心肌肥厚模型，两周后小鼠出现了明显的代偿性的向心性心肌肥厚，伴随有心室壁的增厚以及心室腔的缩小。升主动脉缩窄后，会出现血流动力学上的改变，心脏后负荷增加，改变了一系列神经激素分泌，出现心肌肥厚。在这一过程中，会出现一些与心肌肥厚相关的胎儿期基因的表达升高，例如心房钠尿因子、骨骼肌肌动蛋白和β肌球蛋白重链基因等分子。

图5 荧光定量逆转录聚合酶链反应和免疫蛋白印迹法分析小鼠心肌miR-455的靶基因及靶蛋白表达

在这里第一次证明了在压力超负荷诱导的心肌肥厚小鼠体内miR-455是下调的。如果上调miR-455，会加速了小鼠的心肌肥厚，这与miR-455调控的靶mRNA——CALR密切相关。CALR是一种Ca2+结合分子伴侣，在维持细胞Ca2+稳态和协助蛋白质正确折叠上有关键调控，在成熟心脏中保持在低水平，一旦其基因转录再次活化，蛋白水平升高说明出现了心肌肥大等病理状态。

Tsutsui等[15]应用腹主动脉狭窄的方法，塑造了压力超负荷型的心肌肥厚大鼠模型，对大鼠进行心功能检查与CALR检测，发现大鼠心肌收缩力降低，肌浆网/内质网Ca2+-ATP酶（SERCA）蛋白水平降低，CALR表达上调；应用免疫组化方法，在对照组大鼠心脏中找到了CALR主要分布在间质成纤维细胞。

张振英等[16]发现腹主动脉狭窄可诱导大鼠心肌肥厚，与对照组比较，术后7天模型组大鼠内质网分子伴侣CALR mRNA 表达于术后1天即发生显著上调，较对照组增加136%，而蛋白在术后7天开始出现显著变化，较对照组升高69.2% 。我们的研究与以往研究相一致，即心肌肥厚会伴随CALR升高。实验中下调CALR导致心肌肥厚的加重，Lee等[17]发现CALR可以抑制去甲肾上腺素诱导心肌细胞肥厚，为我们的发现提供了有力的支持。下调CALR后，β肌球蛋白重链有明显增加，但仍可以看出LVEF有所升高，这种表现似乎与β肌球蛋白重链的作用不吻合。已知β-MHC与肌动蛋白的亲和力低于a肌球蛋白重链，故以β肌球蛋白重链为主的心肌收缩力弱，收缩速度减慢而导致心肌收缩功能减退，而本实验仅仅是TAC后两周，β肌球蛋白重链虽然升高，但并不能保证β肌球蛋白重链在肥厚心肌中的作用已超过α肌球蛋白重链，有可能两者最终的作用仍是α肌球蛋白重链为主，至于miR-455对TAC后长期心功能的影响尚需进一步实验证实。并且本实验进一步得出，CALR受到miR-455的调控，即CALR是miR-455的靶蛋白之一，如果上调miR-455那么CALR表现出下调的趋势，而且这种下调是通过降解靶mRNA实现，而非通过抑制其翻译实现。因此，可以通过下调miR-455使得心肌肥厚得到减轻，从而延缓心力衰竭的进程。

通常明显的心肌纤维化和凋亡多发生在慢性心衰的后期，此实验主要探讨短期TAC后miR-455的作用，虽然已出现心肌纤维化和凋亡发生，但miR-455尚未有显著作用，因此miR-455对长期TAC后心肌肥厚的影响还需要进一步实验证实。

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miR-455 Promotes Cardiac Hypertrophy Induced by Short-term Overloaded Pressure in Experimental Mice

WU Chun-tao, LI Yong-jun, LIU Su, WANG Zhi-yong.
Intensive Care Unit, The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050051), Hebei, China

Objective: To investigate the role of miR-455 in cardiac hypertrophy with its potential cellular and molecular mechanism in mice.

microRNA; Cardiac hypertrophy; Calreticulin

2014-08-20）

（编辑：许 菁）

050051 河北省石家庄市，河北医科大学第三医院 重症医学科（吴春涛、王智勇）；河北医科大学第二医院 心内科（李拥军），心外科（刘苏）

吴春涛 副主任医师 博士 主要从事重症医学研究 Email：twbeer126@163.com 通讯作者：吴春涛

R54

A

1000-3614（2015）09-0889-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.016