去甲斑蝥素对人肺腺癌A549细胞的抑制作用

崔宝弟，王敏，孙震晓*

（北京中医药大学中药学院生物制药系，北京100102）

去甲斑蝥素对人肺腺癌A549细胞的抑制作用

崔宝弟，王敏#，孙震晓*

（北京中医药大学中药学院生物制药系，北京100102）

肺癌是当今世界范围内最常见的肿瘤，其总体发病率和死亡率呈上升趋势，已成为各种肿瘤死亡的首要原因，严重威胁人类健康。肺癌也已成为我国近十几年来发病率和死亡率增长速度最快的肿瘤［1］。

2010版药典记载斑蝥有破血逐瘀，散结消癥，攻毒蚀疮的功能［2］。斑蝥在我国己有两千余年的用药历史，现代研究表明它具有明显的抗肿瘤作用［3］。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是斑蝥中抗肿瘤活性成分斑蝥素的去甲基衍生物，与斑蝥素相比，毒性更小，临床上用于肝癌的治疗，对肺癌、乳腺癌和白血病细胞也有较强的抑制作用［4-5］。去甲斑蝥素具有一定升高外周血白细胞的作用，与多数抗癌药物具骨髓抑制的不良反应相比，具有一定的优势［6］。因此，本文研究去甲斑蝥素对人肺腺癌A549细胞的细胞毒作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人肺腺癌A549细胞购于北京协和基础医学研究所细胞库。

1.1.2 试剂与药品 RPMI-1640培养基购自Gibco公司；NCTD购自Sigma公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、四甲基噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium b romide，MTT）、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na）等购自Ameresco公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、 无水乙醇、95%乙醇、浓盐酸、甘油、NaOH等均购自北京化学试剂公司，均为市售分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞用含l0% （V/V）胎牛血清（fetal calf serum，FBS），100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的RPMI-1640培养液，在37 ℃，体积分数为5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，常规换液传代。

1.2.2 细胞计数 采用细胞血球计数板法：取稀释混匀的细胞悬液10 µL，轻轻打入放置盖片的血球计数板中，倒置显微镜下计数，重复3次，取平均值。

1.2.3 MTT法检测NCTD对A549细胞活力的影响 取对数生长期的细胞，以每孔1 000个的密度接种于96孔板，培养 24 h后换含 15、30、40、60、80和120 µmol/L NCTD的培养基。24、48和72 h后加入终浓度为0.5mg/mL MTT溶液，继续培养4 h后，吸去上清，每孔加入150 µL DMSO，在微量振荡器上振荡5～10min，酶标仪在550 nm处测得吸光度值。每次试验取3个平行孔，重复3次。以NCTD浓度为横坐标，以存活率为纵坐标绘制存活曲线，并按下式计算存活率。

1.2.4 细胞恢复试验 取对数生长期细胞，以每孔2 000个的密度接种于96孔板，24 h后换含 30、60、120、240和480 µmol/L NCTD的培养基，并测加药0h的吸光度值D（550）。加药作用24 h后，换未加药培养基继续培养，并测恢复0 h的吸光度值D（550）。后每隔24 h测定吸光度值，连续测定5 d。以天数为横坐标，以存活率为纵坐标绘制存活率曲线。

1.2.5 细胞形态学观察 以每孔1.2×105个的密度取对数生长期细胞接种于6孔板中培养，24 h后加入含40、50、60 µmol/L NCTD的培养基处理0～72 h，在0、24、48、72 h时用倒置相差显微镜观察NCTD作用状态下的细胞形态。

1.2.6 流式细胞术测定细胞周期与凋亡 以每皿2×106个的密度将对数生长期的细胞接种于直径10cm的细胞培养皿内，接种30 h后换含40、50、60µmol/L NCTD的培养基，并收集0 h细胞，后每隔24 h收集24、48和72 h细胞，4 ℃保存过夜。1 000 r/min 离心5 min弃上清。500 µL PBS重悬，加入RNaseA至终浓度20 µg/mL， 37 ℃水浴45 min。再加入PI染液至终浓度50µg/mL，4 ℃避光染60 min。最后流式细胞仪检测1×104个细胞，上机前常规进行光路流路校准。

1.3 统计学方法

所有试验数据采用 SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 NCTD对A549细胞活力的影响

NCTD对肺癌细胞A549生长活力的影响如图1，与对照组相比，在30～240 µmol/L范围内 （ 除30µmol/L的24 h组外），NCTD使A549 细胞活力均明显下降（P均＜ 0.05或P＜0.01），并且随着剂量和时间增加，细胞活力逐渐下降。

2.2 恢复培养5 d细胞的存活率

如图2，在30～240 µmol/L浓度范围内，NCTD对A549细胞的生长抑制作用在药物撤除24 h后逐渐消失，并且在NCTD各个浓度作用下，细胞在随后的几天里有不同程度的恢复。 30～60 µmol/L NCTD作用24h后，A549细胞的活力在恢复培养的第5天完全恢复，与对照组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 NCTD作用后A549细胞形态学观察结果

40、50 和60 µmol/L NCTD作用A549细胞0～72 h，细胞形态变化结果如图3所示。与对照组相比，A549细胞的生长受到抑制，随着作用浓度的增加和作用时间的延长，A549细胞变圆浮起增多。

2.4 细胞周期分析

NCTD作用A549细胞0 h的细胞周期分布为：G0～G1期69.9%、S期21.4%、G2～M期9.4%，凋亡率为0.12%。NCTD作用A549细胞24～72 h的细胞周期如表1～ 3及图4所示。不同浓度NCTD作用0～72 h，对A549细胞表现为明显的G2～M期阻滞，与对照组相比，各浓度NCTD处理组未见明显细胞凋亡发生。

3 讨 论

去甲斑蝥素为斑蝥素的结构同类物，临床上具有较强抗肿瘤活性并有升高外周血白细胞的作用。临床用于肝癌、食管癌、胃及贲门癌等以及白细胞低下症，亦可作为术前用药或用于联合化疗，与其他化疗药物联用能提高疗效、减少副作用。近年来主要用于消化道肿瘤和肺癌的治疗。但是NCTD对肺癌的抑制作用及抗癌机制尚不明确。

本研究表明，NCTD在一定浓度下对肺癌细胞A549的生长有明显抑制作用，并且这种生长抑制作用在NCTD撤除后逐渐消失。NCTD在抑制细胞生长的过程中伴随着细胞变圆浮起，通过流式细胞术发现，NCTD主要通过G2～M期阻滞影响A549细胞的生长。

有研究表明，NCTD可以通过损伤肿瘤细胞DNA，影响细胞周期调控蛋白，从而阻止肿瘤细胞周期，抑制其增殖，例如降低胰腺癌细胞内CDK1的表达，使其停滞于G2～M期［7］；下调宫颈癌细胞中Cyclins B和Cdc2的表达，使其停滞于G2/M期［8］，抑制细胞生长。

我们前期研究发现，NCTD主要通过诱导人卵巢癌SK-OV-3细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡抑制细胞生长。干扰细胞有丝分裂过程中微管的组装和纺锤体的形成可能是NCTD诱导SK-OV-3细胞M期阻滞的原因之一，而NCTD诱导的SK-OV-3细胞发生凋亡可不依赖细胞M期阻滞［9］。另有研究发现，NCTD可以通过破坏胆管癌RBE细胞Tubulin骨架、抑制α-Tubulin mRNA的表达，阻止纺锤体的形成，将细胞周期阻滞在G2～M期，导致生长抑制［10］，我们前期的研究也表明，NCTD 可以在体外抑制微管蛋白的聚合，并在SK-OV-3细胞中得到验证［11］。近年来，科学家新提出一种细胞死亡概念，称为有丝分裂灾变死亡（mitotic catastrophe， MC），用来描述由于细胞有丝分裂异常或细胞长时间阻滞在有丝分裂期而诱发的一种细胞死亡方式，可以在离子辐射、化疗药物或高温作用下发生［12］。NCTD诱导A549细胞G2～M期阻滞是否会导致细胞有丝分裂灾变死亡，尚需要进一步研究。

［1］ 陈万青，张思维，邹小农. 中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势研究［J］. 中 国肺癌杂志，2010，13（5）：488-493.

［2］ 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典Ⅰ部［S］. 化 学工业出版社，2010：312.

［3］ Wang GS. Medical uses of mylabris in ancient china and recent studies［J］. J Ethnopharmacol，1989，26（2）：147-162.

［4］ 张金梅，吴 杰，常 城，等. 去甲斑蝥素对肝癌细胞增殖和凋亡的影响［J］. 中国肿瘤生物治疗杂志，2011，18（1）： 33-37.

［5］ 李 妍，张 铎，方 芳，等. NCTD对白血病细胞DR5表达的影响［J］. 吉 林医药学院学报，2014，35（1）：5-7.

［6］ 李增云，马庆同，张燕，等. 健择与顺铂联合去甲斑蝥酸钠治疗晚期NSCLC疗效观察［J］. 中华肿瘤防治杂志，2014，21（4）：293-295.

［7］ Li W，Xie L，Chen Z，et al. Cantharidin，a potent and selective PP2A inhibitor，induces an oxidative stress-independent growth inhibition of pancreatic cancer cells through G2/M cell-cycle arrest and a poptosis［J］. C ancer S ci，2010，101（5）：1226-1233.

［8］ Dong X，Li JC，Jiang YY，et al. p38-NF-κB-promoted mitochondria-associated apoptosis and G2/M cell cycle arrest in norcantharidin-treated HeLa cells［J］. J Asian Nat Prod Res，2012，14（11）：1008-1019.

［9］ 李瑞婧，洪兴福，季媛媛，等. 去甲斑蝥素诱导人卵巢癌SK-OV-3 细胞发生有丝分裂期阻滞与凋亡［J］. 中国药理学与毒理学杂志，2013，27（2）：180-186.

［10］ 王天阳，王文斌，边伟，等. 去甲斑蝥素对胆管癌 RBE细胞 α-Tubulin 骨架蛋白及细胞周期的影响［J］. 中华临床医师杂志：电子版，2013，7（21）：9581-9585.

［11］ 洪兴福，李宝赛，孙震晓. 去甲斑蝥素对体外微管蛋白聚合的抑制作用［J］. 中国药理学与毒理学杂志，2012，26（5）：630-635.

［12］ Vakifahmetoglu H，Olsson M，Zhivotovsky B. Death through a tragedy：mitotic c atastrophe［J］. C ell D eath D iffer，2008，15（7）：

The inhibition of norcantharidin on human lung adenocarcinoma A549 cells

CUI Baodi，WANG Min#，SUN Zhenxiao*
（Department of Biopharmaceutical， School of Chinese Pharmacology，Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

目的： 研究去甲斑蝥素（NCTD）对人肺腺癌A549细胞的细胞毒作用，并初步探讨其作用机制。方法：采用四甲基噻唑蓝（MTT）试验检测0～240 µmol/L NCTD在0～72 h内对A549细胞活力的影响；NCTD处理A549细胞24 h后换正常培养基，用MTT方法检测细胞恢复与增殖的情况；采用倒置显微镜观察A549细胞经40、50和60 µmol/L NCTD处理0～72 h后细胞形态学的改变；通过流式细胞术检测40～60 µmol/L NCTD对细胞周期和凋亡的影响。结果：30～240 µmol/L NCTD对A549细胞有明显的生长抑制作用（P＜0.05）；在30～120 µmol/L浓度范围内，NCTD对A549细胞的生长抑制作用在NCTD撤除24 h后逐渐消失，30～60 µmol/L NCTD作用A549细胞24 h后，A549细胞的活力在恢复培养的第5天完全恢复；40、50和60 µmol/L NCTD作用A549细胞0～72 h，细胞表现为明显的G2～M期阻滞，与对照组相比，NCTD诱导A549细胞凋亡作用不明显（P＞0.05）。结论：40～60 µmol/L NCTD主要通过诱导A549细胞G2～M期阻滞而抑制细胞生长。

去甲斑蝥素；肺癌；A549细胞；细胞周期；细胞凋亡

OBJECTIVE:To study the effects of norcantharidin （NCTD） on human lung cancer cells，and investigate the mechanisms.METHODS：The growth inhibition of A549 cells treated with 0-240µmol/L NCTD for 0-72hours was analyzed by MTT assay. The recovery growth and proliferation of A549 cells treated with 0-120 µmol/L NCTD for 24 h was evaluated by MTT assay. The morphological changes of A549 cells treated with 40，50 and 60 µmol/L NCTD for 0-72 h were examined under inverted microscope. The apoptosis and cell cycle changes of A549 cells treated with 40-60µmol/L NCTD were detected by flow cytometry.RESULTS：NCTD inhibited the growth of A549 cells in 30-240µmol/L（P＜0.05）. Cell growth inhibition could hardly be detected 24 h after 30-240 µmol/L NCTD was removed from culture medium. The vitality of A549 cells was fully recovered in 5 d after 30-60 µmol/L NCTD was removed from culture medium. A549 cells showed G2-M phase block but no obvious apoptosis compared with the control group when treated with 40，50 and 60 µmol/L NCTD for 0-72 h.CONCLUSION：NCTD （40-60 µmol/L） inhibited human lung cancer A549 cell growth mainly by cell G2-M phase block.

norcantharidin；lung cancer；A549 cell；cell cycle ； apoptosis

R734.2

A

1004-616X（2014）01-0021-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2014.01.005

2014-06-22；

2014-09-23

北京中医药大学自主课题项目（2014JYBZZ-XS097）；北京中医药大学自主课题项目（2013JYBzz-XS088）作者信息： 崔宝弟，E-mail：cbdbaodi@sina.com。#该作者对本文的贡献与

等同。*通信作者，孙震晓，Tel：010-84738646； Email：sunzxcn@hotmail.com