联合检测p53自身抗体与EB病毒VCA-IgA对鼻咽癌的诊断价值

彭裕辉，谢长乐，庄珊珊，张利群，许镒洧，*

（1. 汕 头大学医学院附属肿瘤医院检验科，广东 汕头 515041；2. 开 平市中心医院肿瘤外科，广东开平 529300；3. 汕 头大学医学院附属肿瘤医院信息科，广东 汕头 515041）

联合检测p53自身抗体与EB病毒VCA-IgA对鼻咽癌的诊断价值

彭裕辉1，谢长乐2，庄珊珊1，张利群3，许镒洧1，*

（1. 汕 头大学医学院附属肿瘤医院检验科，广东 汕头 515041；2. 开 平市中心医院肿瘤外科，广东开平 529300；3. 汕 头大学医学院附属肿瘤医院信息科，广东 汕头 515041）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，其发病率高达20～50/10万［1］。早期鼻咽癌患者的5年生存率高达95%，然而，晚期患者5年生存率只有不到70%［2-3］。目前，临床上用于筛查和辅助诊断鼻咽癌的血清标志物主要是EB病毒相关抗体或DNA，但这些检测方法的敏感度和特异度并不够高［4］。因此，寻找高特异度和敏感度的血清标志物成为提高鼻咽癌早期诊断率和改善预后的关键。

研究表明，p53自身抗体在多种肿瘤中具有早期诊断价值［5］。然而，p53自身抗体在鼻咽癌诊断方面的意义并不清楚。本研究应用体外生产纯化的p53作为抗原，检测NPC患者血清中p53自身抗体水平，同时检测EB病毒VCA-IgA作对比，探讨p53自身抗体对NPC的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 一般资料

收集2012年5月-2014年4月汕头大学医学院附属肿瘤医院放疗科的NPC患者242例。所有患者均经病理学确诊且入院前未接收其他治疗。242例NPC患者中，男性179例，女性63例，年龄17～79岁，中位年龄51岁。按AJCC癌症分期手册第七版［6］进行临床分期：I期4例，II期36例，III期141例，IV期61例；其中T1期34例，T2期74例，T3期84例，T4期50例；N0期20例，N1期64例，N2期147例，N3期11例；M0期235例，M1期7例。正常对照218例，为汕头大学医学院附属肿瘤医院医务人员并被证实为无任何肿瘤相关疾患，年龄及性别与鼻咽癌患者尽可能匹配，其中男性134例，女性84例，年龄22～80岁，中位年龄50岁。所有标本均经本院伦理委员会批准。空腹静脉采血3 mL，1 250g离心5 min分离血清，-80 ℃保存备用。

1.2 主要仪器和试剂

BioLogic DuoFlow蛋白纯化系统（美国Bio-Rad公司），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG，中国华美公司），Imperial蛋白染色试剂和酶标仪（美国赛默飞公司），96孔酶标板（江苏海门浩天生物器材厂），辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（美国Santa Cruz公司），3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB，厦门英科新创公司），EB 病毒VCA-IgA检测试剂盒（北京贝尔生物工程公司）。

1.3 p53 重组蛋白的表达与纯化

将带有PDONR223-TP53的质粒与Pdest17混合，加重组酶，25 ℃反应5 min，再将重组产物转化DH5α菌株，37 ℃培养16 h。挑选克隆进行测序验证。将阳性的重组质粒Pdest17- TP53转化rosetta2（DE3）菌株，37℃培养16 h后挑选单克隆用LB液体培养基培养，待菌液浓度在测定波长600 nm的吸光度为0.6时加IPTG诱导，IPTG终浓度为1 mmol/L，诱导3 h，离心收菌；菌体加结合缓冲液，悬浮菌体，超声破菌，离心后取上清过Ni柱，经洗涤缓冲液洗10个柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱靶蛋白。纯化蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，电泳后的凝胶采用考马斯亮蓝染色（Imperial蛋白染色试剂）。

1.4 p53 自身抗体的检测

采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中p53自身抗体。将纯化的p53重组蛋白用PBS稀释到终质量浓度0.1 μg/mL，包被96孔板4 ℃过夜。弃去孔内溶液，用PBST洗板3次。每孔加入200 μL封闭液（PBST+1%牛血清白蛋白），37 ℃孵育1 h，弃去孔内溶液，用PBST洗板3次。加入1∶110稀释的血清样品和质控样品（取自50例NPC患者的混合血清），每孔100 μL，每个血清样本均作两个平行孔，37 ℃孵育1 h，弃去孔中溶液，用PBST洗板3次；加入1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37 ℃孵育1 h，弃去孔中溶液，用PBST洗板3次；每孔加入TMB-过氧化氢尿素显色液100 μL，置于37 ℃避光显色15 min；加入终止液50μL，酶标仪以测定波长为450 nm，校正波长为630nm时检测各样品的吸光度值［即D（450）-D（630）］。218名正常对照血清D值的均数加上2个标准差为判断临界值（Cut-off值），高于此值为阳性，低于此值为阴性。

1.5 VCA-IgA的检测

应用北京贝尔生物工程有限公司的EB病毒VCAIgA检测试剂盒，操作严格按说明书进行。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 p53重组蛋白纯度的鉴定

p53重组蛋白经12% SDS-PAGE电泳，电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色，结果显示p53蛋白的纯度均＞90%（图1），说明已成功获得高纯度的重组p53蛋白。

2.2 血清p53自身抗体的检测

血清p53自身抗体的平均滴度水平在鼻咽癌组（0.236±0.044）显著高于正常对照组（0.048±0.036），差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

2.3 p53 自身抗体检测鼻咽癌的诊断价值

根据Cut-off值的判断标准，p53自身抗体对鼻咽癌的诊断Cut-off值为0.120。p53自身抗体和VCA-IgA对鼻咽癌的诊断价值见表1。单独检测VCA-IgA的敏感度高于单独检测p53自身抗体的敏感度，但差异无统计学意义（P=0.099）。而当p53自身抗体和VCA-IgA联合检测时，诊断敏感度较VCA-IgA组明显提高（P＜0.01）。

本研究中，有40例早期鼻咽癌患者。p53自身抗体和VCA-IgA以及两者联合检测在早期鼻咽癌患者中的表达情况见表2。由表2可知，p53自身抗体和VCA-IgA在鼻咽癌患者组的阳性表达率分别为52.5%和35.0%，均高于正常对照组的阳性表达率（P＜0.01）。两者联合的阳性表达率达到了75.0%，高于正常对照（P＜0.01）。

2.4 p53自身抗体和VCA-IgA的阳性率与鼻咽癌患者临床病理参数之间的相关性

p53自身抗体和VCA-IgA的阳性率在不同性别、年龄、T分期、N分期和TNM分期的鼻咽癌患者间差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。可知当两种标志物联合检测时，其阳性率与鼻咽癌患者临床病理参数之间亦未见明显相关性（P＞0.05）。

3 讨 论

自从Crawford等［7］首先在乳腺癌患者中发现并描述了p53抗体以来，关于肿瘤自身抗原（tumor-associated antigens，TAA）和自身抗体在肿瘤患者中应用的报道不断增加。以往的研究表明，血清p53自身抗体的表达水平在乳腺癌、肺癌和食管癌等多种肿瘤中是显著升高的［5，7-8］。本研究以血清p53自身抗体为主要观察对象，结果显示p53自身抗体对鼻咽癌具有潜在的诊断价值。p53自身抗体对鼻咽癌的诊断敏感度和特异度分别为40.1%（95%CI：33.9%～46.6%）和95.0%（95%CI：90.9%～97.3%），与以往报道的有关p53自身抗体在其他肿瘤中的诊断价值较为一致［8-9］。

早期发现鼻咽癌对改善患者预后至关重要［2-3］。肿瘤自身抗体有希望作为一种有效的癌症早期诊断方法。肿瘤的发生发展是多基因异常协同积累的过程，上游基因p53突变是早期的频发事件。p53基因突变状态下编码的p53蛋白，其半衰期延长并在细胞内堆积，刺激机体免疫系统产生抗p53蛋白的自身抗体［10］。已有研究提示p53自身抗体在癌症发生的早期阶段就已经产生［8，11-12］，这一点在本研究中也得到了证实。本研究中，虽然p53自身抗体在鼻咽癌早期患者和晚期患者的阳性率差异显示无统计学意义（P＞0.05），然而，p53自身抗体似乎在早期患者的阳性率是更高的，而且，p53自身抗体在早期鼻咽癌患者的阳性率高于VCAIgA的阳性率（表2），这些结果提示p53自身抗体极有可能成为一种早期筛查鼻咽癌的标志物。但是，本研究中早期鼻咽癌患者的例数相对较少，因此，在未来的研究工作中，应该进一步在大列队的早期鼻咽癌患者中进行验证。

在本研究中，VCA-IgA对鼻咽癌的诊断敏感度低于Chang等［13］的研究报道，这可能与检测的人群不同有关。显然，VCA-IgA单独检测用于筛查鼻咽癌的敏感度是不够的。作为筛查试验，高敏感度应该是一个先决条件，以便潜在的患者不被漏检，在这种情况下，作为一种权衡，增加敏感度而稍微降低特异度是能够被接受的。p53自身抗体作为一种分子标记物而非传统的EB病毒标志物，与VCA-IgA的联合检测明显提高了鼻咽癌的诊断敏感度，达到了69.4%（95%CI：63.1%～75.0%），而特异度仍然保持在90.8%（95%CI：86.0%～94.2%）。这些结果提示p53自身抗体可作为VCA-IgA的一种补充，用于鼻咽癌的筛查。目前，临床上通过检测EBV-DNA用于筛查鼻咽癌的敏感度和特异度分别可以达到89.1%和85.0%［14］，敏感度高于本研究中p53自身抗体和VCA-IgA的联合检测，但检测EBV-DNA费用高，部分医院技术条件不够，尚未能开展，而检测p53自身抗体和VCA-IgA的方法为ELISA，方法上经济上更可行，更适用于人群中的筛查。

总之，本研究首次评价了p53自身抗体在鼻咽癌中的诊断价值，研究结果揭示了p53自身抗体有可能成为鼻咽癌早期诊断的标志物，p53自身抗体和VCAIgA的联合检测可能有助于鼻咽癌的筛查和诊断，为鼻咽癌的临床诊治提供新方法。

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Combined analysis of autoantibodies against p53and Epstein-Barr virus VCA-IgA for improved diagnosis of nasopharyngeal carcinoma

PENG Yuhui1，XIE Changle2，ZHUANG Shanshan1，ZHANG Liqun3，XU Yiwei1，*
（1. Department of Clinical Laboratory， Tumor Hospital of Shantou University Medical College， Shantou 515041； 2. Department of Surgical Oncology， Kaiping Central Hospital， Kaiping 529300；3. Department of Information， Tumor Hospital of Shantou University Medical College， Shantou 515041， Guangdong， China）

目的： 探讨联合检测p53自身抗体与EB病毒VCA-IgA在鼻咽癌患者中的诊断意义。方法：采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测242例鼻咽癌患者和218 例正常对照者血清中p53自身抗体和EB病毒壳抗体（VCA-IgA）的表达水平。结果：血清p53自身抗体的水平在鼻咽癌患者组明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。p53自身抗体和VCA-IgA对鼻咽癌的诊断敏感度分别为40.1% （95%CI：33.9%～46.6%） 和47.5%（95%CI：41.1%～54.0%）；特异度分别为95.0%（95%CI：90.9%～97.3%）和95.4% （95%CI：91.5%～97.7%），两者联合检测的敏感度和特异度分别为69.4%（95%CI：63.1%～75.0%）和90.8%（95%CI：86.0%～94.2%）。p53自身抗体、VCA-IgA和两者联合检测在早期鼻咽癌患者中的阳性表达均明显高于正常对照组（P均＜0.01）。p53自身抗体的阳性表达率与鼻咽癌患者的性别、年龄、T分期、N分期和总TNM分期之间均无明显相关性（P＞0.05）。结论：血清p53自身抗体作为一种潜在的诊断标志物，与VCA-IgA联合检测可能有助于筛查和诊断鼻咽癌。

p53；自身抗体；EB病毒；VCA-IgA；鼻咽癌；诊断

OBJECTIVE:To evaluate the diagnostic value of serum autoantibodies against p53 in patients with nasopharyngeal carcinoma.METHODS：The study included 242 patients with NPC and 218 normal controls. Serum levels of autoantibodies against p53 and classical Epstein-Barr virus VCA-IgA were measured by Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.RESULTS：Serum levels of autoantibodies against p53 were significantly higher in NPC than in normal controls （P＜0.01）. Measurement of autoantibodies against p53 and VCA-IgA demonstrated a sensitivity/specificity of 40.1% （95%CI：33.9%-46.6%）/95.0% （95%CI：90.9%-97.3%） and 47.5% （95%CI：41.1%-54.0%）/95.4% （95%CI：91.5%-97.7%），respectively. The combination of autoantibodies against p53 and VCA-IgA yielded an enhanced sensitivity of 69.4% （95%CI：63.1%-75.0%） and a similar specificity of 90.8% （95%CI：86.0%-94.2%）. Moreover，detection of autoantibodies against p53 could differentiate early stage NPC patients from normal controls. The positive rate of autoantibodies against p53 was not significantly related to age，gender，T stage，N stage or overall stage （P＞0.05）.CONCLUSION：Autoantibodies against p53 might be used as a potential biomarker supplementary to VCA-IgA for screening and diagnosis of NPC.

p53；autoantibody；Epstein-Barr v irus；VCA-IgA；nasopharyngeal carcinoma；diagnosis

R730.4

A

1004-616X（2015）01-0026-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.006

2014-10-11；

2014-12-07

广东省科技计划项目（2013B021800250）；汕头市医疗科技计划项目（汕府科［2013］88号）

作者信息：彭裕辉，E-mail：pengyuhui666@163.com。*通信作者，许镒洧，E-mail:yuwei512@126.com