大豆苷元对乳腺癌生长和血管生成的影响

康欣梅，王 慧，王 丽，汤大北，张清媛

（哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科，黑龙江哈尔滨 150081）

大豆苷元对乳腺癌生长和血管生成的影响

康欣梅，王 慧，王 丽，汤大北，张清媛

（哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科，黑龙江哈尔滨 150081）

大豆异黄酮（soybean isoflavone）存在于坚果、蚕豆、大豆及豆制品中，具有广泛的营养学价值。其化学结构已经非常明确，基本骨架为3-苯基苯并二氢呋喃，包括染料木黄酮（又名染料木素）（genistein）、黄豆素（glycetein）和大豆苷元（daidzein）3种苷元［1］，染料木黄酮和大豆苷元是大豆异黄酮中活性最为显著的两类［2］。

大豆异黄酮与哺乳动物雌激素有相似的分子结构［3］，能与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合，发挥雌激素样作用［4］，如治疗绝经后女性更年期综合征、抗骨质疏松、抗氧化、心血管保护、抗肿瘤等［4-6］。大豆苷元是大豆异黄酮中的一类，目前的研究发现大豆异黄酮具有诱导癌细胞凋亡［7］、抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭等作用［8］，但对于大豆苷元与肿瘤血管生成关系方面的研究鲜见报道。本研究拟通过建立乳腺癌大鼠模型，检测大豆苷元与乳腺癌大鼠血管调节因子和微血管密度（microvessel density，MVD）的关系，进而探讨大豆苷元对乳腺癌血管生成和肿瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD大鼠，雌性，6周龄，体质量（180±5）g，购自黑龙江省肿瘤防治研究所动物实验中心。生产许可证号：SCXK（黑）2006-2008。使用许可证号：SYXK（黑）2006-030。大豆苷元购自西安飞达生物技术有限公司；7，12-二甲基苯蒽（7，12-dimethylbenz［α］ anthraxcene， DMBA）购自美国Sigma公司；单克隆CD34抗体为美国Santa Cruz公司产品；TUNEL试剂盒购自上海罗氏公司；抗-BrdU抗体（美国Sigma公司）购自上海贸易有限公司；大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和内皮抑素（endostatin）ELISA试剂盒均为美国R&D公司产品。

1.2 乳腺癌大鼠模型的建立及分组

取60只大鼠，每只给予含20 mg DMBA的玉米油1mL灌胃（根据预实验确定造模的DMBA剂量）。约6～8周后可触及肿瘤，当肿瘤生长至300～450 mm3时，将大鼠随机分为5组，每组12只，每日分别给予0（对照组）、10、25、50和75 mg/kg大豆苷元灌胃，继续喂养8周后终止实验。断髓法处死大鼠，立刻心脏穿刺取血离心后储存于-80 ℃冰箱，并将肿瘤切除后称取质量，随后置于10%福尔马林液固定，石蜡包埋，切片。

1.3 微血管密度MVD的检测

取大鼠乳腺肿瘤石蜡标本切片，切片厚约5 μm，二甲苯中脱蜡，高温高压组织抗原修复，按说明滴加CD34抗体，采用免疫组化SP法检测肿瘤的MVD。CD34定位于血管内皮细胞胞浆，呈棕黄色。用CD34免疫染色标本切片，标记其中的微血管，以血管内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准。MVD计数：参照Weidner等［9］报道的方法，即先在低倍镜（40倍）下全面观察CD34染色阳性的血管，选取肿瘤微血管着色细胞密集的区域，然后在高倍镜（200倍）下鉴别着色的血管，并计数。随机选取5个不重复的200倍视野进行计数，求其平均值即为该切片的MVD值。以上免疫组化染色结果均由具备多年病理诊断经验的技术人员3人参与判定。

1.4 肿瘤细胞凋亡测定

荧光素标记的dUBP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，可与凋亡细胞中断裂的DNA的3'-OH末端连接，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的说明来检测凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。随机选取5个不重复的视野进行计数及统计分析。细胞凋亡指数用阳性细胞数占细胞总数的百分率计算。

1.5 肿瘤细胞增殖检测

用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）免疫组织化学检测细胞增殖。每只鼠处死前2h腹膜内给予50 mg/kg BrdU，BrdU标记的细胞核被抗-BrdU抗体所识别。随机选取5个不重复的视野进行计数及统计分析。细胞增殖指数用被标记的细胞数占细胞总数的百分比计算。

1.6 血管生成相关因子的测定

取乳腺癌大鼠心脏部位离心血标本。VEGF、bFGF和内皮抑素水平测定用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，严格按照ELISA检测试剂盒说明书进行操作。具体步骤：根据说明书分别配制VEGF、bFGF和内皮抑素的标准品浓度，向板孔中依次加入0.1 mL标准品，1孔只加样品稀释液作调零孔。酶标板加盖37 ℃反应90 min。甩去板内液体，用吸纸尽量吸干。再依次向各标准品孔中加入0.1 mL酶标抗体工作液，37 ℃反应60 min。后用0.01 mol/L PBS洗涤3次，每次约1 min。然后向各标准品孔中依次加入0.1 mL亲和素-过氧化物酶复合物工作液，37 ℃反应30 min。再用0.01 mol/L PBS洗涤3次，每次约1 min。之后向每孔加入90 μL在37 ℃平衡30 min的显色液，37 ℃避光18 min。随即每孔加入50 μL终止液，液体由蓝转黄。于酶标仪上测定各孔D（450） 值并记录相应浓度。所有试验样本均重复1次。

1.7 统计学方法

所有数据均使用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料采用方差分析，其中两两比较用S-N-K法。以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 大豆苷元对瘤体质量和MVD的影响

与对照组比较，50和75 mg/kg大豆苷元组大鼠瘤体质量较对照组显著减轻（P＜0.05）。大豆苷元对MVD的影响见图1。75 mg/kg大豆苷元组的MVD较对照组明显下降（P＜0.05），其余组的MVD较对照组差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠瘤体质量和MVD的比较±s）

与对照组比较，*P＜0.05.

组

2.2 大豆苷元对大鼠肿瘤细胞凋亡和增殖的影响

与对照组比较，75 mg/kg大豆苷元组的凋亡指数升高（增加了22.5%），差异有统计学意义（P＜0.05）；此浓度组增殖指数虽然降低（减小了8.4%），但差异无统计学意义（P＞0.05）。75 mg/kg组的凋亡/增殖比是对照组的1.5倍，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 大豆苷元对细胞凋亡、增殖和凋亡/增殖比的影响（±s）

与对照组比较，*P＜0.05.

组别凋亡指数（%）增殖指数（%）凋亡/增殖比对照组10. 2± 0. 8 7 4. 7 ± 6 . 20. 14± 0. 03大豆苷元10 m g / k g 9 . 8 ± 0. 7 7 9 . 3± 5. 40. 13± 0. 0325 m g / k g 10. 5± 1. 07 2. 5± 5. 9 0. 16 ± 0. 0250 m g / k g 9 . 5± 0. 9 7 8 . 5± 8 . 30. 12± 0. 017 5 m g / k g 12. 5± 1. 5* 6 8 . 4± 6 . 10. 21± 0. 02*

2.3 大豆苷元对大鼠血液中VEGF、bFGF和内皮抑素表达水平的影响

与对照组比较，25、50和75 mg/kg大豆苷元组大鼠血液中的VEGF水平依次降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05），而50和75 mg/kg组的内皮抑素水平增加，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；各组bFGF水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

3 讨 论

肿瘤的生长依赖于血管的生成最早由Folkman［10］提出，他认为当肿瘤直径超过2 mm时就需要新生血管形成。肿瘤血管的生成是指肿瘤细胞通过分泌细胞因子诱发毛细血管新生，并最终形成微循环网，是由血管生成刺激因子和抑制因子共同调控的复杂过程。诱导血管的生成是恶性肿瘤无限生长、浸润与远处转移的前提之一，在肿瘤的生长过程中，新生的毛细血管既为肿瘤的生长提供了营养物质，又为肿瘤的远处转移准备了条件［11］。因此，如何抑制肿瘤血管生成，是当前肿瘤治疗的热点之一。本研究即是通过抑制大鼠乳腺癌的血管生成，从而抑制乳腺癌的发生发展。

乳腺癌作为一种血管依赖性肿瘤，其生长、转移和复发受多种细胞因子的调节，目前已知的血管生成刺激因子有VEGF、bFGF、转化生长因子1（transforming growth factor，TGF-1）、血小板衍生内皮细胞生长因子等［12］，研究发现VEGF是已知最强的促血管生成因 子［13］，也是目前发现的刺激肿瘤血管形成的最关键因子，在肿瘤血管生成过程中发挥核心作用［14］；血管生成抑制因子有：内皮抑素、血管抑制素（angiostain）、血小板因子-4（platelet factor-4，PF-4）、干扰素-α（interferon-α，IFN-α）等［12］，其中最重要的是内皮抑素。本试验中涉及到的细胞因子有VEGF、 bFGF和内皮抑素，通过血管生成刺激因子和血管生成抑制因子来共同调节大鼠乳腺癌的血管生成。

乳腺肿瘤血管的形成首先打破了局部正性和负性调节因子之间的平衡，诱导宿主血管的增殖反应，而增殖形成的这些微血管不同于正常血管，其结构和功能均表现异常，乳腺肿瘤内的血液灌注量分布不均，血液不能正常流动，肿瘤血管壁发育不成熟，通透性较高，且乳腺癌组织内缺乏淋巴管吸收渗出液，致使乳腺癌内形成了间质高压区［15］。此外，由于间质压在肿瘤边缘处急剧下降，导致大量携带血管生成因子和肿瘤细胞的间质液从肿瘤边缘渗漏到周围正常组织中，从而促进肿瘤的扩散［15-16］。

国内外研究报道，大豆异黄酮抗肿瘤作用的机制有抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抗肿瘤血管生成等。张学增等［17］通过建立胶原诱导性关节炎大鼠模型，发现染料木素能够抑制成纤维样滑膜细胞的增殖；Mizushina等［18］研究发现染料木素通过抑制人类DNA 拓扑异构酶II的活性来抑制癌细胞的增殖；Wang等［19］研究得出染料木黄酮可抑制大鼠动脉平滑肌细胞的增殖。另有研究显示大豆苷元可诱导肿瘤细胞凋亡，康杰芳等［20］研究发现3'-大豆苷元磺酸钠对人乳腺癌细胞MCF-7有促凋亡作用；Choi等［21］研究得出大豆苷元促进人类乳腺癌细胞凋亡可能与ERα/C-erbB-2表达有关。本研究发现大豆苷元可通过调节大鼠乳腺癌细胞因子的表达水平，从而抑制乳腺肿瘤的细胞增殖。

近年来，有不少研究发现植物提取物可抑制肿瘤的血管生成。本课题组前期研究［22］通过建立绝经后大鼠乳腺癌模型，发现染料木素可抑制乳腺肿瘤的血管生成；郑国灿等［23］研究得出牛蒡子苷元对肿瘤血管生成具有抑制作用。而有关大豆苷元与肿瘤血管调节因子和MVD关系的研究还较少，本实验建立了乳腺癌大鼠模型，得出当大豆苷元的剂量在50 mg/kg以上时，大鼠瘤体质量显著减轻，大豆苷元的剂量达到75mg/kg时，凋亡/增殖比显著增加，乳腺肿瘤MVD明显下降，抑瘤效果更显著；当大豆苷元剂量在25 mg/kg以上时，随剂量的增加可下调大鼠乳腺肿瘤中VEGF水平，50 mg/kg以上时可上调内皮抑素水平。提示小剂量的大豆苷元对乳腺肿瘤生长的抑制作用较弱，较高剂量（≥50 mg/kg）的大豆苷元能降低大鼠乳腺肿瘤VEGF水平、增加内皮抑素水平，进而使大鼠乳腺肿瘤的微血管密度下降，可有效抑制乳腺肿瘤生长。

综上所述，大豆苷元的抑瘤作用与抑制肿瘤的血管生成有关，这为针对乳腺癌血管调节因子的靶向治疗提供了新的思路，但是还需要我们深入研究血管调节因子及其受体的调控机制，这些问题的阐明与解决在乳腺癌预防和乳腺癌治疗上均具有重要的意义。

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Effect of daidzein on the growth and angiogenesis of breast carcinoma

KANG Xinmei，WANG Hui，WANG Li，TANG Dabei，ZHANG Qingyuan
（Department of Medical Oncology， Tumor Hospital of Harbin Medical University， Harbin 150081， Heilongjiang， China）

目的：利 用7，12-二甲基苯蒽（DMBA）诱导的大鼠乳腺癌模型，探讨大豆苷元对乳腺癌肿瘤血管生成的抑制作用及机制。方法：建立DMBA诱导的乳腺癌大鼠模型，随机分为对照组、10、25、50和75 mg/kg大豆苷元灌胃组，观察各组肿瘤生长情况，测定肿瘤微血管密度（MVD），并计算各组肿瘤的增殖指数和凋亡指数；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测心脏离心血标本中血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和内皮抑素的水平。结果：与对照组比较，50和75m g/kg大豆苷元组大鼠瘤体质量显著减轻（P＜0.05），75 mg/kg大豆苷元组的凋亡指数增加，其抑制肿瘤血管生成的效果显著（P均＜0.05）。与对照组比较，25、50和75mg/kg大豆苷元组的VEGF水平降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05），同时50和75 mg/kg大豆苷元组的内皮抑素水平增加，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论：较高剂量（≥50m g/kg）的大豆苷元能使大鼠乳腺肿瘤的微血管密度下降，可有效抑制乳腺肿瘤生长。

乳腺癌；大豆苷元；微血管密度；血管内皮生长因子；内皮抑素

OBJECTIVE:To evaluate the inhibitory effects of daidzein on angiogenesis of breast carcinoma，and to study their anti-cancer mechanisms by using the model of 7，12-dimethylbenz［α］anthraxcene （DMBA）-induced breast carcinoma in SD rats.METHODS：The DMBA -treated SD rats were randomly divided into control，10，25，50 and 75 mg/kg daidzein-gavaged groups. The growth of tumors was assessed in each group. The tumor microvessel density （MVD） was determined，and tumor proliferation index and apoptosis index were calculated. Moreover，vascular endothelial growth factor （VEGF），basic fibroblast growth factor （bFGF） and endostatin levels were measured by ELISA.RESULTS：Compared with the control group，tumor mass was reduced more significantly in the 50and 75 mg/kg daidzein groups （P＜0.05）. The apoptosis index of 75 mg/kg daidzein group was increased，and the effect of inhibiting tumor angiogenesis was significant （all P＜0.05）. Compared with the control group，the VEGF levels of 25，50and 75 mg/kg daidzein groups were all decreased，in a dose-dependent manner（P＜0.05），meanwhile endostatin levels were increased in the 50 and 75 mg/kg daidzein groups，and the differences were statistically significant （all P＜0.05）.CONCLUSION：Higher dose of daidzein （≥50 mg/kg） could decrease MVD of mammary tumor and inhibit the growth of breast carcinoma effectively in rats.

breast c arcinoma；daidzein；microvessel density；vascular endothelial growth factor；endostatin

R737.9

A

1004-616X（2015）01-0016-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.004

2014-09-05；

2014-10-22

黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目（1251G040）

作者信息： 康欣梅，E-mail：kxm791107@163.com；Tel：0451-86298683