PP2A B56α亚基介导镉诱导的细胞毒性

李妙，马璐，柏青，陈雯，陈丽萍*

（中山大学公共卫生学院预防医学系，广东 广州510080）

PP2A B56α亚基介导镉诱导的
细胞毒性

李妙，马璐，柏青，陈雯，陈丽萍*

（中山大学公共卫生学院预防医学系，广东 广州510080）

镉及其化合物是环境中常见的重金属污染物，长期的镉暴露与多种人类疾病的发生发展密切相关［1］。研究表明在镉诱导人支气管上皮细胞恶性转化的过程中，镉可以诱导细胞发生凋亡、DNA损伤、DNA损伤修复能力下降以及基因组不稳定［2］。然而，其毒作用的分子机制至今仍未阐明。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是真核生物中最主要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族，调控信号转导、细胞增殖、细胞周期、细胞转化、细胞凋亡等多种细胞生命事件［3-6］。PP2A全酶由核心酶（支架A亚基和催化C亚基组成）与不同的调节B亚基组成，形成至少75种不同组合的PP2A全酶［7］。因此，B亚基的多样性决定了PP2A功能的多样性，特定的PP2A全酶参与特定的信号通路。在我们前期的研究中，发现PP2A全酶的活性与镉诱导的毒性效应密切相关［8］，然而，PP2A通过哪些信号通路来调控镉诱导的细胞毒性有待阐明。本实验室前期利用PP2A亚基缺失细胞模型筛查影响镉诱导细胞毒性的PP2A亚基，发现特异的PP2A亚基如PR110、B56δ 表达抑制后增加镉诱导的细胞毒性［9-10］，与此相反，B56α亚基的表达缺失导致细胞对镉诱导的细胞毒性抵抗。为了阐述B56α在镉诱导的细胞毒性中的作用，本研究在人胚肾上皮细胞HEK构建了PP2A B56α表达降低的细胞模型，并用氯化镉染毒，观察PP2A B56α低表达对镉诱导的细胞毒性及相关信号通路的影响，探讨B56α调控镉诱导的细胞毒性的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和质粒

MEMα基础培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）；Cell Proliferation Kit （WST-1）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）抑制剂SP600125（上海碧云天公司）；氯化镉（CdCl2，购自美国Sigma公司）；anti-B56α抗体（Novus，美国），抗金属硫蛋白（metallothionein， MT）抗体（Genetex，美国），p-JNK抗体（Thr183/Tyr185） （CST，美国）。慢病毒质粒pLKO.1-puro-SHB56α-1和pLKO.1-puro-SHB56α-2（靶向PPP2R5A的不同序列）由美国哈佛大学医学院Hahn教授赠送。

1.2 细胞培养

永生化人胚肾上皮细胞HEK由美国哈佛大学医学院Hahn教授赠送，在含有10%胎牛血清的MEMα培养基中，于37 ℃恒温、CO2体积分数为5%、饱和湿度的温箱中培养。

1.3 实验方法

1.3.1 PP2A B56α缺陷细胞株的构建 pLKO.1-puro-SHB56α和包装质粒VSVG、△8.9通过磷酸钙法稳定转染293FT细胞，获得含有目的基因的病毒颗粒。病毒颗粒通过0.45 μm滤器过滤后感染HEK细胞，经嘌呤霉素筛选，免疫印迹验证，获得B56α缺陷细胞株HEKSHB56α-1和HEK-SHB56α-2。同步转染pLKO.1-puro-SHGFP获得对照细胞HEK-SHGFP。

1.3.2 细胞毒性实验分别收集细胞，消化后按每孔6×103个细胞用排枪接种到96孔板，贴壁培养24 h。按浓度0、10、20、40、80 μmol/L配制CdCl2染毒液。将细胞培养基吸走，每孔加入100 μL染毒液继续培养24h。倾斜培养板，小心吸弃染毒液，再加入含10 μL WST-1溶液的培养基100 μL，继续在培养箱中孵育1.5h，置摇床上混匀5 min，使用酶标仪于570 nm波长处测定各孔吸光度值。以细胞相对活力评估细胞毒性大小，其计算公式为：

细胞相对活力=［处理组D（570）值-空白孔D（570）值］/［对照组D（570）值-空白孔D（570）值］×100%

1.3.3 免疫印迹检测B56α和MT的表达以及JNK的磷酸化水平 细胞消化后按每皿5×105个接种，贴壁培养24 h，用终浓度为0、10、20、40、80 μmol/L的CdCl2染毒24 h，或用40 μmol/L的CdCl2染毒不同时间（在0、2、6、12、24 h收集）。另设SP600125与CdCl2同时处理组：相应浓度的CdCl2染毒液加终浓度为10μmol/L的SP600125溶液。细胞收集后直接用2×SDS上样缓冲液裂解以获得总蛋白，并使用细胞破碎仪（30%，超声5 s，停顿1 s）处理样品，6%～12%梯度胶分离蛋白，湿转法将蛋白转移到NC膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，然后分别加入抗B56α（1∶2 000）、p-JNK （Thr183/Tyr185）（1∶1 000） 以及MT（1∶800）的抗体4℃ 孵育过夜，次日用PBS/T洗3次，每次5 min，再加入山羊抗兔或抗鼠IgG-HRP （1∶10 000），室温孵育1 h。加上ECL发光剂进入暗室使用X光胶片曝光成像。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 PP2A B 56α表达抑制对CdCl2诱导细胞毒性的影响

在调控镉诱导细胞毒性的PP2A亚基的初步筛查中发现B56α缺失降低镉诱导的细胞毒性。为了进一步验证，将靶向B56α的两个有效干扰片段（排除靶外效应）导入HEK细胞，构建B56α表达降低的稳定细胞株。图1A和B显示，HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2细胞中B56α 的表达分别为对照细胞HEK-SHGFP的21%和28% （P＜ 0.05），表明PP2A B56α表达降低的细胞株构建成功。用不同剂量的CdCl2染毒细胞株24 h，图1C显示随着CdCl2染毒剂量的增加，细胞相对活力逐渐下降。和对照细胞相比，PP2A B56α表达降低的细胞株的相对活力升高了10%～32% （P＜0.05），提示B56α表达降低导致镉诱导的细胞毒性降低。以上结果表明B56α在镉诱导的细胞毒性中起作用。

2.2 CdCl2对JNK磷酸化的诱导作用

用不同剂量（0、10、20、40、80 µmol/L）的CdCl2处理HEK细胞，发现JNK（Thr183/Tyr185）的磷酸化水平（p-JNK）和MT表达水平随CdCl2的剂量增加而增加（P＜ 0.05）（图2A）。当用40 µmol/L CdCl2处理HEK细胞不同时间（0、2、6、12、24 h）后，与处理0 h组相比，观察到p-JNK和MT的表达水平随时间增加逐渐增加（P＜ 0.05），在12 h达到峰值（图2B）。这些结果提示JNK的磷酸化可能与MT的诱导表达相关。

2.3 JNK磷酸化增加促进MT的表达并降低镉诱导的细胞毒性

为了进一步证实MT的表达受JNK的磷酸化调控，分别用20 µmol/L和40 µmol/L CdCl2处理HEK细胞12h，p-JNK和MT的表达水平显著增加（图3A和B）。然而，当联合JNK抑制剂SP600125（10 µmol/L）作用时，p-JNK水平则下降35%～38%（P＜0.05），MT的表达也下降了13%～35%（P＜0.05），表明抑制JNK的磷酸化激活导致MT的表达下降。同时观察到在JNK抑制剂SP600125和CdCl2同时作用下，HEK细胞的细胞相对活力降低6%～ 20% （P＜0.05） （图3C）。以上这些结果进一步证实JNK磷酸化激活影响MT的表达，且JNK磷酸化和MT的表达增加可以抵抗CdCl2诱导的细胞毒性。

2.4 抑制PP2A B56α表达对JNK磷酸化水平的影响

为了证实PP2A B56α可能通过调控JNK的磷酸化来调控MT表达的推测，用40 µmol/L CdCl2处理B56α表达降低的细胞株HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2，观察B56α表达降低对CdCl2诱导JNK磷酸化水平的影响。结果发现，与HEK-SHGFP细胞相比，上述2株细胞中的JNK的磷酸化水平分别增加了2.78倍和1.26倍（P＜0.05），同时MT的表达也分别增加了1.36倍和1.19倍（P＜0.05）（图4A），提示JNK磷酸化水平受PP2A B56α调控。此外，还发现用40 µmol/L CdCl2作用HEK细胞不同时间（0、2、6、12、24 h），和处理0 h组相比，B56α的表达水平呈下降趋势（P＜0.05），JNK的磷酸化则显著增加（P＜0.05），MT的表达也呈升高的趋势（P＜0.05）（图4B），提示在重金属应激下，B56α降低有利于激活JNK 调控MT表达的相关通路。以上结果进一步说明PP2A B56α可能通过调控JNK的磷酸化水平来影响MT的表达，进而影响CdCl2诱导的细胞毒性。

3 讨 论

镉的长期暴露与DNA损伤、细胞凋亡、氧化应激等多种分子事件相关［2］。近年来，PP2A相关信号通路在环境化学物毒性通路中的作用受到广泛的关注［4，6，9，11］。PP2A各亚基的突变缺失以及表达异常会导致PP2A功能失调。本研究发现PP2A B56α在镉诱导的细胞毒性中起着重要的作用，并揭示了B56α通过介导JNK的去磷酸化来影响MT的表达，进而调控镉诱导的细胞毒性的关键分子事件。

金属硫蛋白（MT）是一类含半胱氨酸的小分子的金属结合蛋白。它属于应激蛋白，在重金属或氧化应激时诱导表达升高［12-13］，能够维持锌铜稳态、解除重金属毒性、清除氧自由基等［14-16］。MT的表达升高可被认为是环境重金属暴露毒性效应的保护机制［12］。因此，阐明MT的表达调控机制，有助于找到重金属毒作用的关键信号通路，为重金属污染物的防治提供靶点。

金属调控转录因子-1（metal-regulatory transcription factor-1，MTF-1）是调控MT基因表达的关键因子［17］。研究表明MTF-1的活性受磷酸化调控，且由蛋白激酶PKC、 JNK、MKK4等介导［18］，其中JNK的磷酸化激活能进一步使MTF-1发生磷酸化，并促进其转录活性［18］。相一致的是，我们也观察到CdCl2作用下JNK的磷酸化水平增加进而上调MT的表达。JNK属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kidnase，MAPK）超家族成员，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。JNK信号通路在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡中起着重要的作用［19-20］。JNK信号通路可通过磷酸化促凋亡或抗凋亡相关蛋白而表现促进凋亡和抑制凋亡的两面性［21-23］。而本研究发现JNK活性受抑制后导致CdCl2诱导的细胞毒性增加，可能原因是其抑制MTF-1的活性进而影响MT的诱导表达，这个结果进一步证实JNK在细胞对重金属应激中起着重要作用。

特异PP2A全酶可以通过调控特定的信号通路来影响重金属诱导的细胞毒性，我们以往的研究发现PP2A PR110通过去磷酸化作用激活MTF-1调控MT表达［9］，而PP2A B56δ抑制后增加镉诱导的细胞毒性［9-10］。以往研究表明JNK的磷酸化受到蛋白磷酸酶的调控［24］。本研究则发现B56α通过调控JNK磷酸化来影响MT表达，表明B56α是CdCl2应激时决定细胞命运的关键分子。相一致的是，在心肌细胞JNK的持续激活通过上调AUF1使PP2A B56α表达降低［25］，表明JNK的磷酸化激活与PP2A B56α密切相关。然而，PP2A B56α是否直接调控JNK去磷酸化有待进一步阐明。

综上，本研究揭示了PP2A B56α参与镉诱导的细胞毒性的作用及分子机制。期望这些关键分子能为镉暴露的毒性机制更深入的阐明提供线索和依据，为环境化学物毒性通路的预测提供理论依据。

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Role of PP2A B56 α subunit in cadmium-induced cytotoxicity

LI Miao，MA Lu，BAI Qing，CHEN Wen，CHEN Liping*（Faculty of Preventive Medicine， School of Public Health，
Sun-Yat Sen University， Guangzhou 510080， Guangdong， China）

目的：探 讨蛋白磷酸酶2A（PP2A）B56α亚基在调控CdCl2诱导的细胞毒性中的作用及其机制。方法：利用病毒感染法在人胚肾上皮细胞HEK上构建PP2A B56α表达降低的细胞株模型（HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2），采用改良四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测CdCl2诱导的细胞毒性。用不同浓度（0、10、20、40和80μ mol/L）CdCl2联合或不联合c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂SP600125染毒细胞不同时间（0、2、6、12和24 h），采用免疫印迹检测B56α亚基、金属硫蛋白（MT）的表达和JNK的磷酸化水平。结果：免疫印迹结果证实细胞株HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2构建成功。与对照组比较，PP2A B56α表达抑制导致镉诱导的细胞毒性减小，JNK的磷酸化水平和MT的表达水平均显著增加。用不同剂量CdCl2处理细胞株12h ，发现B56α表达抑制导致JNK磷酸化（p-JNK）分别增加了2.78和1.26倍（P＜0.05），MT的表达也分别增加了1.36和1.19倍（P＜0.05）。用p-JNK抑制剂SP600125作用时，p-JNK的表达降低了35%～38%（P＜0.05），MT的表达下降了13%～35%（P＜0.05）， CdCl2诱导的细胞毒性显著增加（P＜0.05）。此外，用CdCl2处理细胞不同时间点，B56α的表达逐渐降低（P＜0.05），而p-JNK和MT的表达水平呈逐渐增加趋势（P＜0.05）。结论：PP2A B 56α在调控CdCl2诱导的细胞毒性中起着重要作用，其作用机制可能通过介导JNK的去磷酸化调控MT的表达而发挥作用。本研究揭示了PP2A参与重金属应激的关键靶点和信号通路的调控。

氯化镉；细胞毒性；蛋白磷酸酶2A；p-JNK；金属硫蛋白

OBJECTIVE:To identify involvement of protein phosphatase 2A B56α in the regulation of cytotoxicity induced by cadmium chloride （CdCl2） and address the underlying molecular mechanism.METHODS：Stable cell lines were generated by infecting HEK cells with lentiviral shRNA targeting B56α subunit. Modified MTT was performed to detect the cytotoxicity induced by CdCl2. Immunoblotting analysis was applied to examine the expressions of B56α，p-JNK and MT in cells treated with different concentrations of CdCl2or co-treated with SP600125.RESULTS：Immunoblotting results verified that stable cell lines HEK-SHB56α-1 and HEK-SHB56α-2 were successfully established. We found that suppression of PP2A B56α reduced the cytotoxicity induced by CdCl2. In addition，the phosphorylation status of c-Jun N-terminal kinases （JNK） and the expression level of MT were significantly increased in response to CdCl2. Suppression of B56α led to a 2.78 or 1.26-fold（P＜0.05） increase of p-JNK in cells treated with CdCl2for 12 h，and a 1.36 or 1.19-fold （P＜0.05） increase of MT. Upon SP600125 treatment，the expression level of p-JNK and MT were reduced by 35%-38% （P＜0.05） and 13%-35%（P＜0.05），respectively，while cytotoxicity induced by CdCl2was enhanced（P＜0.05）. More-over，the expression of B56α was lowered（P＜0.05），but p-JNK and MT were increased（P＜0.05）in a time-dependent manner upon CdCl2treatment.CONCLUSION：PP2A B56α regulated MT expression via dephosphorylating JNK，and affecting the cytotoxicity induced by CdCl2. Our study demonstrated that PP2A B56α participated in regulating the targets and pathways in response to metallic stress.

CdCl2；cytotoxicity；protein phosphatase 2A；p-JNK；metallothionein

R994.6

A

1004-616X（2015）01-0011-06

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.003

2014-09-25；

2014-12-03

国家自然科学基金青年基金项目（31401213）

作者信息： 李妙，E-mail：michellelee3828@hotmail.com。*通信作者，陈丽萍，E-mail：chenliping_happy06@163.com