洋地黄毒苷对肺癌NCI-H446与A549细胞增殖和周期的影响

刘 锋，陈志添，邵孔健，萨本仲

（福州市第二医院肝胆外科，福建 福州 350007）

洋地黄毒苷对肺癌NCI-H446与A549细胞增殖和周期的影响

刘 锋，陈志添，邵孔健，萨本仲

（福州市第二医院肝胆外科，福建 福州 350007）

肺癌是全球癌症导致死亡中最常见的病因，80%的肺癌属于非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC），而70%的NSCLC确诊时已为晚期，常规化疗药物在治疗肺癌过程中易产生多药耐药性，寻找新靶向药物治疗肺癌愈发迫切［1］。1999年Haux等［2］对9 000多例因心脏疾患使用洋地黄毒苷的患者进行了药物疗效分析，证实血液中洋地黄毒苷的较高浓度与血液和泌尿系统肿瘤较低发生率相关联，洋地黄毒苷血浆浓度小于21 nmol/L的患者肿瘤发生率是血浆浓度在21～29 nmol/L患者的3.3倍。这提示心脏疾病患者服用洋地黄毒苷后，其正常血浆浓度即可抑制肿瘤细胞增殖，洋地黄毒苷可在低于导致心脏毒性的浓度下发挥抑制肿瘤的作用。已有研究发现洋地黄毒苷在体外抑制人肝癌、前列腺癌、白血病等多种肿瘤细胞增殖［4-6］，诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤效应。但对强心苷药物洋地黄毒苷发挥抗肿瘤作用的机制尚不清楚。本研究通过体外培养肺癌NCI-H446和A549细胞，采用不同浓度洋地黄毒苷作用于2种细胞后，探讨洋地黄毒苷对肺癌NCIH446和A549细胞增殖和周期的影响，从细胞周期调控蛋白表达变化初步分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人肺癌NCI-H446与A549细胞均购自于中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养液为Gibco公司产品；胎牛血清购自天津市灏洋生物制品公司；二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑蓝（methylthiazolyl-diphenyltetrazolium bromide，MTT）为Sigma公司产品；洋地黄毒苷（购自美国Sigma公司，纯度＞99.9%，用DMSO溶解，配成10μ mol/L贮存液，过滤后分装，-20℃ 保存备用）；裂解液、蛋白浓度测定试剂盒、细胞周期检测试剂盒和化学发光试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；鼠抗人Cyclin A 1、P21单克隆抗体购于Santa C ruz公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记的山羊抗小鼠IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

人肺癌NCI-H446与A549细胞分别接种于体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度条件下细胞培养箱中传代培养。待细胞汇合率达到70%～80%进行细胞传代，先用PBS漂洗细胞后加入0.25%胰酶（含0.01% EDTA）消化细胞，再用RPMI-1640完全培养液将细胞从瓶壁上洗脱，2～3 d传代1次。取对数生长期的细胞用于试验。

1.3 MTT法测定洋地黄毒苷对细胞增殖的影响

取对数生长期人肺癌NCI-H446与A549细胞，分别用胰酶消化，用RPMI-1640培养液调整细胞密度为5× 104/mL，接种于96孔板中，每孔接种100μ L。在37 ℃ 、CO2体积分数为5%条件下培养过夜后，吸出培养液，加入新鲜培养液180 μL及药液20 μL。取出用DMSO溶解配制的洋地黄毒苷母液，用培养液稀释至终浓度为10、20、40、80、160 nmol/L。每个药物浓度平行设4孔，同时设置对照组，对照组中每孔加入20 μL的PRMI-1640培养液。分别培养24、48、72 h，每孔加入5mg/mL的MTT 20 μL，在37 ℃培养箱中孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型震荡器上摇匀15 min，待结晶完全溶解，放入酶标仪中测定490nm波长处吸光度值。计算药物对肿瘤细胞的增殖抑制率。

1.4 流式细胞术测定洋地黄毒苷对细胞周期的影响

取对数生长期的人肺癌NCI-H446与A549细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清PRMI-1640培养液制备浓度为4.0×104/mL的细胞悬液，接种于50 mL细胞培养瓶中，每瓶接种5 mL。培养过夜后，吸弃培养液，加入新鲜培养液及洋地黄毒苷药液，使其终浓度为10、40、160 nmol/L，同时设置对照组，对照组加入相同体积的细胞培养液。在给药后24 h，消化离心收集细胞，PBS洗2次，细胞沉淀用70%乙醇悬浮，在-20 ℃冰箱固定24 h。PBS离心洗去乙醇后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（含50mg/L PI，10 mg/L RNaseA，0.1% TritonX-100，0.1%柠檬酸钠和0.5% NaCl），室温下避光染色30min，400目筛网过滤，用流式细胞仪检测DNA含量，分析细胞周期（激发波长488 nm，发射波长630 nm）。

1.5 Western blot 检测洋地黄毒苷对细胞周期相关蛋白表达的影响

对于贴壁的人肺癌NCI-H446与A549细胞分别先用预冷的PBS润洗3次，加入200 μL 细胞裂解液与苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，终浓度100 μg/mL）混合液，放置于冰上裂解10 min，提取细胞总蛋白。用BCA法进行蛋白定量。加入加样缓冲液，沸水煮沸5 min使蛋白质变性，经SDS-PAGE电泳后转膜。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜用含50 mg/mL BSA的TBST室温封闭3 h，一抗（1∶500）4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min；加入相对应二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST洗3次，每次10min；用化学发光法检测Cyclin A1和P21蛋白的表达情况，置于多功能凝胶成像仪扫描分析印迹条带光密度值。目的蛋白相对表达量用目的条带光密度值与内参β-acitn蛋白光密度值的比值表示。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 洋地黄毒苷对人肺癌NCI-H446和A549细胞增殖的影响

不同浓度洋地黄毒苷（10、20、40、80和160n mol/L）对肺癌NCI-H446和A549细胞增殖均有明显抑制作用，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，对细胞增殖抑制的效果越来越明显，呈现时间和浓度依赖性（P＜0.05）。洋地黄毒苷分别作用肺癌NCI-H446和A549细胞48 h后，半数抑制浓度IC50值依次为61.26 和110.73nmol/L。与A549细胞相比，NCI-H446细胞株表现为对洋地黄毒苷的增殖抑制作用更为敏感。

2.2 洋地黄毒苷对人肺癌NCI-H446和A549细胞周期的影响

洋地黄毒苷对人肺癌NCI-H446和A549细胞周期各时期DNA含量的影响如图2和表1所示。洋地黄毒苷能使细胞周期阻滞于S期。随着洋地黄毒苷药物作用浓度的增加，在NCI-H446与A549细胞中，分别与对照组相比，G1/G0期细胞周期比例显著下降（P＜0.05）， S期细胞周期比例显著上升（P＜0.05），而G2/M期细胞周期变化不明显（P＞0.05）。

2.3 洋地黄毒苷对细胞周期调控相关蛋白表达的影响

洋地黄毒苷对NCI-H446和A549细胞周期调控相关蛋白Cyclin A1和P21表达的影响如图3所示：随着洋地黄毒苷作用浓度的增加，Cyclin A1蛋白表达水平均出现下降，与对照组相比，洋地黄毒苷能显著抑制Cyclin A1的表达（P＜0.05）；而P21蛋白表达水平随着洋地黄毒苷作用浓度的增加而出现上升，与对照组相比，洋地黄毒苷能显著提高P21蛋白的表达（P＜ 0.05）， 并呈浓度依赖性。

3 讨 论

近些年来的研究发现强心苷类固醇（cardiotonic sterroids，CTS）对人的多种恶性肿瘤如肝癌、前列腺癌、白血病和非小细胞肺癌细胞等具有广谱及高选择性抗肿瘤活性，而对人的正常细胞杀伤作用极弱［3-6］。在Johnasond等［4］的研究中，哇巴因诱导人前列腺癌细胞系PC23凋亡的IC50为0.152 μmol/L， 而诱导良性增生的前列腺细胞系BPH21凋亡的IC50＞100μ mol/L。目前临床常用的化疗药物大多对肿瘤细胞和正常细胞没有显著的选择性，而CTS由于对肿瘤细胞的选择性细胞毒效果而使其将有可能发展成为一类重要的抗肿瘤药物。

洋地黄毒苷作为正性肌力药物，临床上用于治疗心力衰竭和心房颤动已有200多年的历史，药理学背景非常清楚，安全血浆药物浓度高。已有多项研究发现其在安全血浆药物浓度内可以有效抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。如Hallbook等［7］研究了洋地黄毒苷、地高辛和哇巴因的抗白血病作用，发现洋地黄毒苷效果最好，特别是对来自病人的B-precursor ALL 和T-ALL细胞非常敏感，IC50值在安全血浆浓度范围内。Lopez-lazaro等［6］研究了洋地黄毒甙和地高辛等对肾上腺癌细胞株TK-10等3种肿瘤细胞株的抑增殖作用，发现洋地黄毒甙的IC50值在3～33 nmol/L之间，低于其治疗慢性心功能障碍的有效血浆浓度。Elbaz等认为，洋地黄毒苷及其类似物可能将成为一类新型的抗肿瘤药物［8］。

在细胞周期运行中，参与调控的蛋白主要包括3种：细胞周期蛋白（Cyclin）、周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）及周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）。其中Cyclin及CDK为正性调节蛋白，CKI为负性调控蛋白，调控因子在G1/S、G2/M两个关键限制点进行调控［9］。而几乎所有肿瘤细胞都存在细胞周期调控机制的破坏而导致细胞生长失控，大多数抗肿瘤药物可以使细胞周期阻滞于G1期、S期或G2/M期。研究发现，CTS也能通过干预肿瘤细胞周期进程，而抑制肿瘤细胞的增殖，不可逆的引起细胞生长停滞［10］。

Xu等［6］将哇巴因、蟾毒素体外作用于人肝癌HepG-2和SMMC-7721细胞，能显著性抑制细胞增殖，肿瘤细胞内Ca2+内流，细胞发生明显凋亡，呈现时间、浓度依赖性。流式细胞仪检测分析，肝癌细胞周期被阻滞于S期。在岳瑶等［11］的研究中，100 nmol/L 布法林作用于人胃癌MGC-803细胞48 h，G2/M期细胞所占比率由对照组的12.18%增至53.19%，其机制与周期负调控因子p16、p21和pRb蛋白表达上调有关。也有报道布法林可引起人卵巢肿瘤细胞G0/G1周期阻 滞［12］，提示CTS作用于不同的细胞系可能影响不同控制点造成细胞周期阻滞。在本实验中，使用流式细胞仪检测肺癌NCI-H446和A549细胞周期分布情况，结果显示，随着药物作用浓度的增加，G1/G0期细胞所占比例出现下降，而S期细胞所占比例出现显著性上升，人肺癌NCI-H446和A549细胞发生S期阻滞。

在细胞增殖与调控的过程中，正性调节因子Cyclin A1与负性调控因子P21蛋白扮演着重要作用。Cyclin A1属S期和M期周期蛋白，可分别与CDK2和CDK1结合。实验表明，Cyclin A1/CDK2可以激活DNA 聚合酶α，在S期能促进DNA合成与染色体复制，进而促使细胞越过G2/M期转折点，进入M期［13］。P21是一种周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子，Cyclin、CDK 和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）是它发挥生物学功能的结构基础。当DNA损伤或细胞衰老时，p53增加并诱导p21转录，p21与相应的CDK-Cyclin复合物结合，抑制蛋白激酶的活性，阻滞细胞周期［14］。本研究观察了不同浓度洋地黄毒苷对周期调控相关蛋白Cyclin A1、P21表达的影响。结果表明，随着药物作用浓度的增加，正性调控因子Cyclin A1表达量明显下调，而负性调控因子P21蛋白表达水平明显上升，并呈浓度依赖性。

综上所述，洋地黄毒苷对人肺癌NCI-H446和A549细胞的增殖有显著性抑制作用，并能明显影响细胞周期时相分布，使NCI-H446和A549细胞阻滞于S期。初步推断，对S期调控相关的正性（Cyclin A1）、负性（P21）调节因子表达水平同时发挥干预效应，可能是洋地黄毒苷对人肺癌NCI-H446和A549细胞发挥S期阻滞、影响细胞增殖的分子机制之一。

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Effect of digitoxin on proliferation and cell cycle of NCI-H446 and A549 cells

LIU Feng，CHEN Zhitian，SHAO Kongjian，SA Benzhong
（Department of Hepatobiliary Surgery， The Second Hospital of Fuzhou， Fuzhou 350007， Fujian， China）

目的： 探讨洋地黄毒苷对肺癌NCI-H446与A549细胞增殖和细胞周期的影响，并初步探讨其可能的作用机制。方法：体外培养的NCI-H446与A549细胞分别经不同浓度（10、20、40、80、160 nmol/L）的洋地黄毒苷处理24、48和72 h后，采用MTT法检测细胞增殖情况，应用流式细胞术检测洋地黄毒苷处理细胞48 h后各组细胞周期分布，Western blot检测细胞中Cyclin A和P21蛋白表达水平。结果：与未经洋地黄毒苷处理的对照组相比，不同浓度（10、20、40、80和160 nmol/L）的洋地黄毒苷均可抑制 NCI-H446与A549细胞的增殖， 均呈剂量和时间依赖性（P＜0.05），作用48 h后，洋地黄毒苷对NCI-H446与A549细胞的IC50值分别为61.26 nmol/L和110.73 nmol/L。流式细胞仪分析结果显示，随药物作用浓度增加，G0/G1细胞比例降低，S期细胞比例显著增加，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot分析结果显示，洋地黄毒苷能剂量依赖性的下调Cyclin A1蛋白表达和上调P21 蛋白的表达（P＜0.05）。结论：洋地黄毒苷可抑制体外培养的肺癌NCI-H446与A549细胞增殖，诱导细胞发生S期阻滞，其机制可能与细胞周期相关调控蛋白的表达有关。

洋地黄毒苷；肺癌；细胞周期调控；细胞周期蛋白A1

OBJECTIVE:To investigate the effects of digitoxin on proliferation and cell cycle of human lung cancer cell lines NCI-H446 and A549，and to explore its possible mechanisms.METHODS：NCI-H446 and A549 cells were treated with digitoxin at different concentrations（10，20，40，80 and 160 nmol/L）. The effect on proliferation of NCI-H446 and A549 cells were detected by MTT assay. Flow cytometry was used to test the cell cycle distribution of NCIH446 and A549 cells. Protein expressions of Cyclin A1 and P21 in NCI-H446 and A549 cells were evaluated by Western blot.RESULTS：As compared with control group，cell proliferation was inhibited by digitoxin in a dose- and timedependent manner（P＜0.05），the IC50value for digotoxin were 61.26 nmol/L in NCI-H446 and 110.73 nmol/L in A549 at 48 h. After 48 h treatment，the proportion of NCI-H446 and A549 cells in G0/G1 phase was decreased，while the proportion in S phase was increased. Western blot analysis showed that digitoxin could significantly up-regulate the expression of Cyclin A1 and down-regulate the expression of P21 in a dose-dependent way（P＜0.05）.CONCLUSION：Digitoxin could exert an the anti-proliferative effect on NCI-H446 and A549 cells and induce S phase arrest in vitro. The mechanism may be related to the expressions of proteins associated with cell cycle.

digitoxin；lung cancer；regulation of cell cycle；Cyclin A1

R734.2

A

1004-616X（2015）01-0006-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.002

2014-07-14；

2014-10-21

福州市科技计划项目（2011-S-67-4）

作者信息： 刘 锋，E-mail：508788420@qq.com； Tel：18046041710