UHRF1蛋白在结直肠癌中的表达情况及其预后判断价值

2015-12-16吴李飞郝佳洁张彤彤梁建伟王明荣

癌变·畸变·突变 2015年1期

吴李飞，郝佳洁，张彤彤，梁建伟，王征，张钰，徐昕，蔡岩，王明荣，*，李敏，*

（1. 安徽医科大学附属安庆医院，安庆市立医院消化内科，安徽安庆 246003；2. 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021；3. 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所腹部外科，北京 100021）

吴李飞1，郝佳洁2，张彤彤2，梁建伟3，王征3，张钰2，徐昕2，蔡岩2，王明荣2，*，李敏1，*

结直肠癌是世界第3大恶性肿瘤，其全球每年新发病例超过130万，死亡人数约70万，而在我国其发病率和死亡率均已分别达第4和第5位，且近年来发病人数呈明显上升趋势［1］，对人民的生命健康构成重大威胁。目前，结直肠癌的主要治疗手段是外科手术切除，术后辅助放化疗等以提高根治率，但由于局部复发和淋巴结转移等因素的影响，结直肠癌患者术后生存时间及生活质量仍不容乐观。为此，检测结直肠肿瘤中的分子改变，挖掘与肿瘤患者预后相关的生物学标志物，探索对某种治疗方法敏感个体的共同特征将可能有助于对不同生物学特征的结直肠癌患者实施个体化治疗，改善预后。

UHRF1（ubiquitin-like PHD and ring finger domains 1），即泛素样含PHD和环指域1，是近年新发现的一种与细胞生长有关的核蛋白基因，其编码的蛋白又称ICBP90/NP95，由类泛素（ubiquitin-like，UBL）模体、PHD（plant homeodomain）结构域、锌指模体（zinc finger motif）和SET-环指状结构域（SET-and ring-associated domain，SRA）4部分组成［2］。UHRF1的表达与细胞的分化程度和增殖能力相关，即分化程度越低、增殖能力越强，UHRF1的表达水平也越高，例如外周血白细胞和中枢神经细胞等高分化非肿瘤细胞中未见UHRF1表达，而在胎儿和成人胸腺、胎肝、睾丸和骨髓等增殖细胞中UHRF1的表达水平较高［3］。近来文献报道，该蛋白在肺癌［4-5］、乳腺癌［6］、膀胱癌［7］、前列腺癌［8］、胃癌［9］、甲状腺癌［10］和喉鳞癌［11］等多种肿瘤组织中上调，其高表达与肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鳞癌［11］患者的术后生存时间负相关，且均为独立预后因子。

Kofunato等［12］在结直肠癌中也发现UHRF1过表达现象，但未就其对结直肠癌患者的预后判断价值进行评估。本研究采用组织微阵列联合免疫组织化学技术（tissue microarrays and immunohistochemistry，TMAIHC）检测结直肠癌患者癌组织及其相应癌旁组织中UHRF1蛋白的表达水平，并分析其与结直肠癌患者临床病理指标的相关性，探讨UHRF1蛋白是否可作为结直肠癌预后判断的分子标志物，为结直肠癌患者治疗方式的进一步优化提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床标本收集

收集201例结直肠癌手术切除的肿瘤组织及其配对手术切端形态学正常的上皮组织。全部病例于2006-2010年期间在中国医学科学院肿瘤医院收取，均经病理学诊断证实为结/直肠腺癌，其中男性119例，女性82例；年龄14～91岁，中位年龄59岁；肿瘤T2、T3、T4期分别为16、118和67例；有和无淋巴结转移分别为110和91例；肿瘤高、中、低分化分别为8、163和30例。其中有完整随访病例167例，中位生存时间为46.7个月（2.8～103.6个月）。所有患者术前均未接受放、化疗等任何抗肿瘤治疗。标本取材后均进行常规福尔马林固定和石蜡包埋。

1.2 组织芯片制备

对组织标本石蜡块进行切片、HE染色，显微镜下阅片，选取相应的组织蜡块并采点标记。每个病例标记3个典型的癌组织点和2个正常组织点，利用穿刺针管将标记好的供体腊块中的组织移入受体腊块，制作成组织微阵列。每张组织微阵列切片厚度为4 μm。

1.3 免疫组化染色

石蜡组织芯片经常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶15 min，0.1%枸橼酸钠缓冲液中微波加热修复20 min；滴加一抗（鼠抗人UHRF1单抗，BD公司），并将片子置于湿盒内4 ℃ 过夜；PBS浸洗后滴加二步法免疫组化检测试剂盒PV9000 （中杉金桥生物技术公司）中的试剂Ⅰ（增强剂）和试剂Ⅱ（ HRP标记聚合物），在37 ℃孵箱中分别孵育20和30 min；DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性胶封片后镜检。

1.4 免疫组化评分

阳性信号定位于细胞核，不同病例蛋白表达差异主要在于阳性信号强度的不同。根据表达强度将评分分为4级：0分（不着色），1分（浅棕色），2分（棕黄色），3分（深棕色）。每例肿瘤及配对的手术切端形态学正常的组织点均分别进行评分，取各自最高分为最终评分。

1.5 统计学分析

使用统计学分析软件SPSS 21.0进行数据分析。利用配对样本t检验分析UHRF1蛋白在肿瘤组织和手术切端形态学正常的上皮组织中的表达差异，采用双侧χ2检验方法分析蛋白表达改变与临床病理指标的相关性。采用Kaplan-Meier方法分析UHRF1蛋白表达与患者术后总生存时间之间的关系，进一步通过Cox比例风险模型分析不同临床病理指标和UHRF1蛋白表达水平对患者术后生存时间的影响。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 UHRF1蛋白在结直肠癌组织中的表达情况

免疫组化结果显示，UHRF1蛋白阳性表达主要定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色，在不同患者肿瘤组织中的表达水平差异较大（图1）。UHRF1蛋白在结直肠癌组织中表达阳性率为54.2%（109/201），其中强表达、中度表达和弱表达的频率分别为15.4%（31/201）、12.4%（25/ 201）和26.4%（53/201）；而在配对的手术切端形态学正常的上皮组织中阳性率仅为9.93%。UHRF1蛋白表达在肿瘤与正常组织之间具有显著性差异（P＜0.01）。

2.2 UHRF1蛋白表达与结直肠癌患者临床病理指标之间的关系

我们进一步分析了UHRF1蛋白表达与结直肠癌患者临床病理指标之间的关系，结果显示UHRF1蛋白表达除了在近端结肠（回盲部、升结肠、结肠肝曲、横结肠及结肠脾曲）、远端结肠（降结肠、乙状结肠）和直肠等不同部位的肿瘤组织中存在显著性差异（P=0.008），远端结直肠癌中的阳性率显著高于近端结肠癌外，而UHRF1蛋白表达与其他临床病理指标均无显著相关性（表1）。

2.3 UHRF1蛋白阳性表达与患者术后生存时间的关系及其独立预后判断价值

Kaplan-Meier分析结果显示，UHRF1蛋白的表达与结直肠癌患者术后生存时间显著相关，该蛋白表达阳性患者的术后生存时间显著短于表达阴性患者的术后生存时间（P=0.023）（图2）。Cox回归分析表明，UHRF1蛋白表达（P=0.008）、分化程度（P=0.011）和淋巴结转移（P=0.005）为结直肠癌患者术后的独立预后因素（表2）。

3 讨论

多项研究显示UHRF1在人类多种恶性肿瘤中表达上调［4-11］，参与细胞增殖［12-14］、凋亡［15-16］、细胞周期调控［17］等重要的生物学过程，并与肿瘤放化疗敏感性相关［15，18-19］。Jenkins等［14］发现UHRF1的锌指结构对维持泛素连接酶的活性至关重要，敲降UHRF1对人肺癌细胞和宫颈癌细胞的生长有明显抑制作用，Daskalos等［4］有类似报道；而Hopfner等［20］研究显示在人肺成纤维细胞中过表达UHRF1后接触抑制现象被削弱。Li等［15］将UHRF1正义转染乳腺癌细胞，发现UHRF1过表达可同时降低肿瘤细胞自发凋亡和辐射所引起的细胞凋亡，Abbady等［16］的研究结果也支持这一现象。Jeanblanc等［17］研究认为UHRF1通过与甲基化RB1基因启动子结合，促使细胞从G1期进入S期，参与细胞周期调控。UHRF家族所特有的SRA结构域与半甲基化的GG位点有很高的亲和性，使DNA在复制过程中维持甲基化状态，导致RASSF1［4］、CDKN2A［4，13］和BRCA1［6］等抑癌基因永久沉默。此外，Li［15］、Un［18］和Muto［19］的研究表明，UHRF1的高表达在肿瘤放化疗敏感性中具有重要作用，有可能作为肿瘤放化疗增敏的新靶点。

在我们的研究中，UHRF1在结直肠癌及其配对正常组织中的阳性表达率分别为54.2%和9.93%，前者显著高于后者（P＜0.01）。Kofunato等［12］的研究表明结直肠癌中UHRF1表达率为65.8%（152/231），而在正常结直肠上皮中则未见UHRF1的表达。由于结直肠手术切端正常组织在包埋和切片过程中可能出现横纵切面的差别，导致一些切片中基底层上皮细胞很少。因此我们推测，上述结直肠正常腺上皮中的表达差异可能是由于纵横切面差异造成的，当然也不排除这种差异可能与二者阳性标准及样本取材位置有关。值得关注的是，我们还发现UHRF1的阳性表达与肿瘤位置有关，总体看来远端结直肠癌的阳性率显著高于近端结肠癌组织。另一方面，与之前在肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鳞癌［11］等研究相一致，UHRF1的表达与结直肠癌的预后呈负相关关系（P=0.023），而且是一种结直肠癌根治术患者的独立预后因子（P=0.008）。

综上所述，UHRF1的阳性表达与结直肠癌患者预后较差显著相关。检测UHRF1蛋白的表达水平变化可能有助于对结直肠癌患者进行预后评估，然而其在结直肠癌发生进展过程中的作用机制仍需要进一步研究。

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［17］ Jeanblanc M，Mousli M，Hopfner R，et al. The retinoblastoma gene and its product are targeted by ICBP90：a key mechanism in the G1/S transition during the cell cycle［J］. Oncogene，

Expression and prognostic
value of UHRF1in colorectal cancer

WU Lifei1， HAO Jiajie2，ZHANG Tongtong2，LIANG Jianwei3，WANG Zheng3，ZHANG Yu2，XU Xin2，CAI Yan2，WANG Mingrong2，*，LI Min1，*
（1. Department of Gastroenterology， Anqing City Hospital， Affiliated Anqing Hospital of Anhui Medical University， Anqing 246003，Anhui； 2. State Key Laboratory of Molecular Oncology，Cancer Institute/Hospital， Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021；3. Department of Abdominal Surgery， Cancer Institute/Hospital，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021， China）

目的：探讨泛素样含PHD和环指域1（UHRF1）蛋白在结直肠癌中的表达及其预后判断价值。方法：采用组织微阵列联合免疫组织化学（TMA-IHC）技术检测201例结直肠癌中UHRF1蛋白的表达情况，分析其与临床病理指标及术后生存时间之间的相关性。结果：UHRF1蛋白在结直肠癌组织中的表达阳性率为54.2%（109/201），显著高于配对的手术切端形态学正常的组织（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存分析显示，UHRF1蛋白表达阳性患者术后生存时间短于表达阴性的患者（P=0.023）。Cox回归分析结果表明，UHRF1蛋白是结直肠癌患者根治术后的一个独立预后因素（P=0.008）。结论：UHRF1蛋白可能作为结直肠癌患者术后预后判断的分子标志。

UHRF1；结直肠癌；分子标志；预后判断

OBJECTIVE:This study aimed to evaluate the expression and prognostic significance of ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1 （UHRF1） protein in colorectal cancer （CRC）.METHODS：The expression of UHRF1 in 201 CRC cases and adjacent normal tissues were detected by tissue microarrays and immunohistochemistry（TMA-IHC），then the relationship between UHRF1 protein expression and clinio-pathological parameters as well as its prognostic value were examined by statistical analysis.RESULTS：Positive expression of UHRF1 was observed in 54.2%（109/201） of CRC tissues，and the frequency in CRC was significantly higher than that in adjacent nomal tissues （P＜0.01）. Kaplan-Meier survival curves showed that CRC patients with negative expression of UHRF1 had shorter overall survival time （P=0.023）. Cox regression analysis indicated that UHRF1 protein expression was an independent prognostic factor（P=0.008）.CONCLUSION：UHRF1 might be a biomarker f or prognostic evaluation of CRC patients.

UHRF1；colorectal cancer；molecular marker；prognostic evaluation

R735.3

1004-616X（2015）01-0030-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.007

2014-11-17；

2014-12-30

公益性行业科研专项（201402003）

作者信息：吴李飞，E-mail：wulifei0556@yeah.net。*通信作者，王明荣，E-mail：wangmr2015@126.com；李敏，E-mail：lmin0556@163.com