骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肾脏结缔组织生长因子的干预效果

张　瑞　(咸阳市第一人民医院肾内科，陕西　咸阳　712000)



骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肾脏结缔组织生长因子的干预效果

张瑞(咸阳市第一人民医院肾内科，陕西咸阳712000)

〔摘要〕目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对糖尿病大鼠肾组织纤维结缔生长因子(CTGF)表达的影响。方法SD大鼠高脂高糖喂养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立2型糖尿病模型，并按随机数字表法分为:糖尿病肾病对照组(DN)、干细胞移植组(MSC)、前列地尔组(AL)。非糖尿病大鼠作为正常对照组(NC)。MSCs经体外培养、鉴定、标记后，经尾静脉注射到MSC大鼠体内(6×106MSCs/ml)，同时AL大鼠每日经尾静脉注射10 μg·kg－1·d－1，连续注射21 d。于开始治疗后第7、14、21天测定大鼠血糖、24 h尿总蛋白、血肌酐、尿素氮，采用HE染色观察大鼠肾脏病理变化并应用免疫组化检测肾组织CTGF蛋白的表达。结果与NC组比较，造模鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐、尿素氮均显著升高(P＜0. 05); 与DN组比较，MSC组及AL组血肌酐、尿素氮、尿蛋白均显著降低(P＜0. 05);与NC组比较，DN组肾组织CTGF表达显著升高(P＜0. 05);与DN组比较，MSC组及AL组肾组织CTGF表达显著降低(P＜0. 05)，但仍高于NC组(P＜0. 05);与AL组比较，MSC组血肌酐、尿素氮、尿蛋白、肾组织CTGF的表达均显著降低(P＜0. 05)。结论MSCs可以抑制CTGF蛋白的过度表达，进而减缓DN的病程进展。

〔关键词〕糖尿病肾病;骨髓间充质干细胞;结缔组织生长因子

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要并发症之一，约30%的糖尿病患者会发展DN。Allard等〔1〕报道，高血糖、非酶糖基化产物和血流动力学紊乱均可刺激肾脏合成及释放一些细胞因子，如转化生长因子(TGF-)β、纤维结缔生长因子(CTGF)等，CTGF是一种重要的促纤维化因子，在肾脏可由系膜细胞、成纤维细胞产生，CTGF的表达升高是导致DN肾纤维化的重要原因〔2〕。Semedo等〔3〕利用MSCs治疗由于大部肾脏切除所致的残余肾纤维化模型，发现MSCs能够使体内能趋化、归巢到受损伤组织，并且能减轻肾脏纤维化。因此本实验拟探讨MSCs对DN的治疗机制。

1　材料与方法

1. 1实验动物2只体质量为90～100 g健康雄性SD大鼠作为MSCs供鼠，54只体质量为(200±10)g雄性SD大鼠54只，清洁级(徐州医学院实验动物中心提供)，饲养于标准环境。自由进食，12 h光照周期。

1. 2试剂胎牛血清(FBS)购自杭州四季青，L-DMEM培养基购自北京赛默，抗鼠CD29、CD90、CD34购自Biolegend公司，5-溴脱氧尿苷嘧(BrdU)购自沃宏，链脲佐菌素(STZ)购自Sigma，CTGF及BrdU抗体购自Boster，前列地尔购自北京泰德制药股份有限公司。

1. 3 MSCs的培养、鉴定和标记取90～100 g雄性SD大鼠，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剪去股骨、胫骨两端，用生理盐水反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬浮液，1 200 r/min离心5 min后弃去上清液，在细胞沉淀中加入含10%FBS的L-DMEM培养液，混匀后接种在于25 cm2培养瓶中，37℃，5%二氧化碳(CO2)孵育箱培养。待细胞生长融合至80%～90%时进行传代，通过反复传代对细胞进行扩增纯化。取扩增2代(P2)的大鼠MSCs，体外诱导成骨细胞，诱导21 d后行茜红素染色鉴定钙结节〔4〕;用流式细胞仪检测鉴定表型抗原CD90、CD29、CD34。P3代细胞达到80%～90%融合时，加入含2%血清的BrdU终浓度为10 μmol/L的L-DMEM培养基，37℃，5%CO2孵育3 d。

1. 4造模与分组将SD大鼠采用完全随机方法分成对照组12只和造模组42只。适应性喂养1 w后，造模组大鼠饲予高糖高脂饲料(在普通饲料的基础上加上20%的猪油，5%的奶粉、10%的蔗糖)。喂养8 w后，造模组大鼠以35 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射STZ(溶于0. 1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 4. 2)，对照组大鼠按相同剂量注射柠檬酸缓冲液。STZ注射2 w后，尾静脉取血，随机血糖(PG)≥16. 7 mmol/L伴胰岛素敏感性降低〔5〕，则DN成模。STZ注射6 w后，出现尿微量白蛋白＞30 mg/24 h尿，则DN造模成功。造模成功的SD大鼠按随机数字表法分为: DN组、干细胞移植组(MSC组)、前列地尔组(AL组)。非糖尿病大鼠作为正常对照组(NC组)。按上述标准，实验研究中4只造模大鼠死亡，2只不符合标准。

1. 5处理用生理盐水将BrdU标记的P3代MSCs制成单细胞悬液，取0. 5 cm经尾静脉注射(6×106/ml)MSCS组大鼠1次，AL组大鼠每日经尾静脉注射剂量10 μg·kg－1·d－1，连续21 d;同时，NC组、DN组尾静脉注射等量生理盐水。

1. 6标本收集及检测处理7、14、21 d将大鼠置于代谢笼内收集24 h尿液过滤后－80℃保存，以作尿蛋白定量测定。随后称量大鼠体重，用水合氯醛腹腔内注射麻醉，下腔静脉采血，取血清－80℃保存待测尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)。剖腹后取出大鼠双肾，用生理盐水灌洗后，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，以备免疫组织化学和HE染色普通光镜检查。

1. 7肾脏病理检测取10%甲醛溶液中固定的肾脏，经常规脱水、石蜡包埋、切5 μm薄片，HE染色，光镜下观察其形态。

1. 8免疫组织化学检测CTGF表达将石蜡包埋的肾组织制成5 μm厚切片后行免疫组织化学分析，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。①切片常规脱蜡脱水，3%的双氧水室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶，双蒸水洗5 min，3次;②抗原修复:切片浸入0. 01 mol/L柠檬酸缓冲液中用微波进行抗原修复，冷却后PBS洗涤3次;③滴加第一抗体(一抗)即兔抗鼠CTGF，抗体(1∶50稀释，4℃过夜)，37℃复温30 min，PBS浸洗，3 min，2次;④次日每张切片滴加试剂一，37℃温箱30 min，PBS浸洗3 min 2次;⑤每张切片滴加试剂二，37℃温箱20 min。PBS浸洗，5 min 4次;⑥最后在室温、显微镜下DAB显色、观察显色效果，当显色5～20 min，观察至DAB显色呈棕黄色时用自来水终止显色;⑦DAB显色终止后，再用苏木素轻度复染、盐酸分化、碳酸锂返蓝，依次用下列酒精梯度(75%，80%，95%，100%Ⅰ，100%Ⅱ)脱水、二甲苯透明、封片。同时采用PBS代替第一抗体的方法作为阴性对照。结果判断:阳性着色呈棕黄色。每个标本在400倍光镜下随机选取8个视野，采用Olympus公司图像采集系统进行半定量分析，染色阳性部位的深浅以平均光密度值表示。

1. 9 Brdu荧光免疫组化检测5 μm石蜡切片，经二甲苯脱蜡，酒精脱水，1%Triton X-100室温作用20 min，PBS洗涤3次，5 min。2NHCL变性30 min，PBS洗涤3次，5 min。1%BSA封闭1 h，滴加Brdu一抗(1∶50稀释，4℃过夜)。37℃复温30 min，FITC-IgG室温1 h，甘油封片后荧光显微镜观察。

1. 10统计学方法采用SPSS16. 0软件，计量资料以x ±s表示，两独立样本均数比较采用t检验，2组以上均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐者应用LSD检验进行组间两两比较，方差不齐者用Tamhane’s T2检验进行比较。

2　结果

2. 1 MSCs的分离纯化、体外扩增、鉴定扩增第3代的大鼠MSCs，形态呈基本一致的长梭形、旋涡状生长(图1)。体外诱导成骨细胞钙结节染色阳性，证明成骨细胞诱导成功(图2)。经流式细胞仪检测，所培养的细胞表达CD90阳性率为95. 98%，CD29阳性率为92. 93%，CD34阳性率为2. 16%。

图1　 P3代大鼠MSCS(×200)

图2　 P2代大鼠MSCS诱导成骨(×200)

2. 2各组大鼠PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白比较在各时间点，DN组、MSC组及AL组PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白较NC组明显升高(均P＜0. 05); MSC组及AL组Scr、BUN、24 h尿蛋白较DN组显著降低(均P＜0. 05)，与AL组比较，MSC组上述指标明显减少，但没有统计学意义(P＞0. 05); MSC组PG较NC组显著减少(均P＜0. 05)，AL组BG与DN组比较没有统计学意义(P＞0. 05)。见表1。

2. 3肾组织病理光镜下NC组大鼠肾组织形态正常; DN组可见肾小球系膜区基质增生，系膜细胞增多，少数肾小球出现轻度硬化;肾小管壁不规则增厚，部分肾小管上皮细胞空泡变性，管腔变窄;局灶性的小管间质纤维化。MSC组、AL组上述病理改变均有不同程度的减轻(图3)。

表1　各组大鼠PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白比较(x ±s，n=12)

2. 4肾组织CTGF的表达NC组大鼠在肾小球、肾小管上皮细胞偶有CTGF阳性表达; DN组大鼠肾小管上皮细胞CTGF阳性表达显著增加，肾间质区也有表达。与DN相比，MSC组和AL组，CTGF表达量均显著减少(P＜0. 05)。见表2，图4。

2. 5免疫荧光结果免疫荧光图片可见标记的MSC定位在肾小球、肾小管和肾间质。见图5。

图3　各组3 w大鼠肾组织HE染色(×400)

表2　各时间点大鼠肾组织CTGF蛋白的表达(x ±s，n=12)

图4　各组大鼠肾组绢CTGF(DAB，×400)

图5　第14天BrdU免疫荧光(×400)

3　讨论

DN主要病理改变特点为肾小球细胞外基质聚集、肾小球硬化及进展性肾小管间质纤维化。纤维化是糖尿病慢性并发症的主要病理特征之一。迄今为止，其确切的发病机制尚未完全明了。除了蛋白激酶C(PKC)学说、氧化应激(OS)学说、细胞因子学说及遗传分子学说之外，许多实验和临床资料均提示糖尿病肾病还存在炎细胞浸润和细胞因子、炎症介质水平上升，炎症可能单独或作为上述机制的下游环节在DN损害的发病机制中起关键作用〔6，7〕。其中CTGF在DN肾脏纤维化中的作用已经得到广泛认同〔8，9〕。因此，抑制CTGF的表达可以延缓DN的进展。MSCs具有易采集且体外大量扩增并不丢失细胞核型和表面标志、可自我更新、能向多种类型细胞分化、增殖能力强并能分泌多种细胞因子〔10～12〕，因而是一种具有重要应用价值的种子细胞。本实验利用全骨髓培养法体外培养的细胞呈贴壁生长，能诱导成为成骨细胞，并通过流式细胞仪测定其干细胞表面抗原CD90、CD29为阳性，白细胞表面特征抗原CD34为阴性，说明培养的细胞为干细胞而非同样具有贴壁特性的白细胞，从而确保输注前的细胞为具有分化功能的MSCs〔13，14〕。本研究将体外扩增并标记的MSCs输注入制模成功的DN大鼠，经荧光免疫组化发现在肾脏中存在标记的干细胞，说明干细胞能定向趋化到受损的肾脏。MSC组大鼠血糖、Scr、BUN、24 h尿蛋白明显降低;肾脏病理图片发现与DN组比较，MSC组大鼠肾脏病变明显减轻，说明MSCs能延缓肾脏纤维化的进程，对肾脏有明显的保护作用;从免疫组化方法中蛋白的表达情况来看，MSCs对DN大鼠肾脏保护作用的机制可能是通过降低肾组织CTGF的表达，抑制肾组织纤维化，进而延缓DN的病程进展。

4参考文献

1 Allard J，Buleon M，Cellier E，et al．ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats〔J〕．Am J Physiol Renal Physiol，2007; 293(4): F1083-92.

2 Nadia Wanab，Dimity Cox，Abigail Witherden，et al．Connective tissue growth factor(CTGF)promotes activated mesangial cell survival via upregulation of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1(MKP-1)〔J〕．Biochem J，2007; 406(1): 131-8.

3 Semedo P，Correa-Costa M，Antonio Cenedeze M，et al．Mesenchymal stem cells attenuate renal fibrosis through immune modulation and remodeling properties in a rat remnant kidney model〔J〕．Stem Cells，2009; 27(12): 3063-73.

4 Lee SH，Jang AS，Kim YE，et al．Research modulation of cytokine and nitric oxide by mesenchymal stem cell transfer in lung injury/fibrosis〔J〕．Respir Res，2010; 11: 16.

5罗志锋，牟娇，齐伟，等. 4-苯基丁酸对糖尿病肾病大鼠的作用〔J〕．中华肾脏病杂志，2010; 26(5): 358-62.

6 Dronavalli S，Duka I，Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropathy 〔J〕．J Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008; 4(8): 444-52.

7 Elmarakby AA，Abdelsayed R，Yao LJ，et al．Inflammatory cytokines as predictive markers for early detection and progression of diabetic nephropathy〔J〕. J EPMA，2010; 1(1): 117-29.

8 Huang J，Matavelli LC，Siragy HM. Renal(pro)renin receptor contributes to development of diabetic kidney disease through transforming growth factor-β1-connective tissue growth factor signalling cascade〔J〕．Clin Exp Pharmacol Physiol，2011; 38(4): 215-21.

9 Hirokazu Okada，Tomohiro Kikuta，Tatsuya Kobayashi，et al．Connective tissue growth factor expressed in tubular epithelium plays a pivotal role in renal fibrogenesis〔J〕．J Am Soc Nephrol，2005; 16: 133-43.

10 Shen YQ，Feng ZY，Lin CT，et al．An oligodeoxynucleotide that induces differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells to osteoblasts in vitro and reduces alveolar bone loss in rats with periodontitis〔J〕．Int J Mol Sci，2012; 13: 2877-92.

11 Keum Seok Bae，Joon Beom Park，Hyun Soo Kim，et al．Neuron-like differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕．Yonsei Med J，2011; 52(3): 401-12.

12 Tngel F. Vasculatropic，paracrtne actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury〔J〕．Am J Physiol Renal Physiol，2007; 292(5): 1626-35.

13 Lee DH，Joo SD，Han SB，et al．Isolation and expansion of synovial CD34(－)CD44(+)CD90(+)mesenchymal stem cells: comparison of an enzymatic method and a direct explant technique〔J〕．Connect Tissue Res，2011; 52(3): 226-34.

14 Bonab MM，Alimoghaddam K，Talebian F，et al．Aging of mesenchymal stem cell in vitro〔J〕．BMC Cell Biol，2006; 7: 14 .

〔2014-01-07修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

·心、脑血管及代谢性疾病·

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5753-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 031

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R589

第一作者:张瑞(1988-)，女，硕士，住院医师，主要从事糖尿病肾病研究。