电针对鱼藤酮诱导的帕金森病模型大鼠黑质内ERK1/2及TNF-α的影响

王述菊　马　骏　王彦春　曾晓玲　龚元勋　梁　艳　孙国杰(湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北　武汉　430065)



电针对鱼藤酮诱导的帕金森病模型大鼠黑质内ERK1/2及TNF-α的影响

王述菊马骏王彦春曾晓玲龚元勋梁艳孙国杰
(湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北武汉430065)

〔摘要〕目的探讨电针对帕金森病(PD)模型大鼠黑质内ERK1/2信号通路及炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α的作用及机制。方法雄性健康SD大鼠32只，随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组，每组8只。模型组和电针组经颈背部注射鱼藤酮造模14 d，造模后进行行为学评价，电针组给予电针“风府”和“太冲”两穴治疗，连续治疗14 d;其余各组不做治疗，假手术组给予相同剂量的DMSO和生理盐水混合液。采用免疫组化法检测大鼠黑质区磷酸化的ERK1/2、酪氨酸羟化酶(TH)、TNF-α阳性细胞表达情况。结果各组大鼠神经行为学表现存在差异，与正常组、假手术组相比，模型组大鼠黑质区TH阳性细胞数减少(P＜0. 05)，磷酸化的ERK1/2、TNF-α阳性细胞数增加(P＜0. 05);与模型组相比，电针组大鼠黑质区TH阳性细胞数增加(P＜0. 05)，磷酸化的ERK1/2、TNF-α阳性细胞数减少(P＜0. 05)。结论电针可以通过调节PD模型大鼠体内MAPK/ERK1/2通路，降低p-ERK1/2在PD模型大鼠黑质区的表达，进而减少TNF-α的表达，对PD病的发生发展起到一定的调节作用。

〔关键词〕帕金森病;电针; MAPK/ERK1/2; TNF-α;酪氨酸羟化酶

1　材料与方法

1. 1实验动物及分组健康雄性SD大白鼠32只，体重(180± 20)g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供〔(合格证: SCXK(鄂)2010-0009，No. 4209800307〕。所有动物均在通风良好条件下分笼饲养，自由摄食、饮水。将动物随机分成正常组、假手术组、模型组及电针组，各8只。实验对动物的处理方法符合2006年中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1. 2主要药物试剂及器材鱼藤酮(rotenone)(美国Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO)(国药集团化学试剂有限公司)、p-ERK、TNF-α抗体(北京博奥森公司)，兔抗鼠TH单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，4%多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)，10%水合氯醛(按国产分析纯水合氯醛1 g，无菌生理盐水9 ml比例配制)，S-P超敏试剂盒(鼠/兔)(福州迈新生物技术开发有限公司)，山羊抗兔免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司)，所有试剂均以焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的双蒸水配制。0. 30 mm×13 mm不锈钢毫针(苏州产华佗牌)，G6805-2型电针治疗仪(上海医疗器械厂)。

1. 3造模方法大鼠适应环境1 w后随机分组，开始造模，采取颈背部皮下注射鱼藤酮法制备PD大鼠模型。用DMSO和生理盐水溶解鱼藤酮配制成0. 25 mg/ml溶液(鱼藤酮∶DMSO∶生理盐水= 1 g∶3. 5 L∶0. 5 L)。其中模型组和电针组按1 mg· kg－1·d－1注射鱼藤酮〔3〕，假手术组经相同方式给予相同体积的DMSO和生理盐水混合液(DMSO∶生理盐水= 3. 5 L∶0. 5 L)，1次/d，连续14 d，正常组不予注射。

参照Chen等〔4〕行为学评分标准，PD模型大鼠出现典型的毛色变黄变脏、弓背、拘捕减弱、震颤等表现视为造模成功。

1. 4针刺方法电针组:对造模成功后的大鼠给予电针治疗，给大鼠穿上自制的鼠衣固定，取“风府”、“太冲”穴，用0. 30 mm×13 mm不锈钢毫针针刺，进针约4 mm，接G6805-2型电针治疗仪，正极接“风府”穴，负极接“太冲”穴(双侧“太冲”穴每天交替)，采用连续波，频率为2 Hz，刺激强度以大鼠腿部轻微抽动为度(2～6 mA)，治疗20 min，1次/d，7 d为1个疗程，疗程间休息1 d，共治疗2个疗程后根据预定时间分别取材。其他组每天在相同时间抓取固定，但不给予治疗。四组动物同步喂养、取材。

1. 5样本采集四组处理结束24 h后，大鼠用10%水合氯醛(0. 4 g/kg)麻醉，仰卧位固定，开胸，暴露心脏，用灌胃针经左心室穿刺入升主动脉，剪开右心耳，先用0. 1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)左心室灌流冲洗，后用含4%多聚甲醛磷酸缓冲液常规灌洗固定，待大鼠全身僵硬后，迅速断头取脑，留取中脑部分置于4%多聚甲醛中固定48 h(4℃)。石蜡包埋切片。

1. 6 S-P免疫组化法检测脑组织行冠状面连续切片(厚度约4 μm)，常规脱蜡至水，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);柠檬酸抗原修复液煮沸对组织进行抗原修复;滴加50 μl过氧化酶阻断溶剂后孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);同一组织相邻切片分别加入一抗即兔抗鼠TH单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)(1∶200)、羊抗鼠p-ERK、TNF-α单克隆抗体(北京博奥森公司)(1∶100); 4℃过夜; PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);加入50 μl二抗室温下孵育10 min，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);滴加50 μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);二氨基联苯胺(DAB)显色;苏木素复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂封固;镜下观察。阴性对照一抗用PBS代替，其余步骤同以上操作。选定黑质所在区域，使用IMS图像分析系统软件分析。每组观察5张切片，每张切片在光镜高倍镜下随机取4个4 mm2视野，计算阳性反应细胞数，各组每张切片的4个视野阳性细胞计数相加后取平均值。

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1. 7统计学方法应用SPSS16. 0软件进行单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，继而以SNK-q检验处理数据。P＜0. 05为差异有统计学意义。

2　结果

2. 1大鼠行为学改变观察鱼藤酮注射5 d后即有大鼠表现出捕捉时反抗减弱的现象，逐渐出现主动活动减少、爬行活动缓慢、震颤、拱背状姿势、瞬目减少、对刺激逃避反应慢等类似PD症候群特征;另外，鱼藤酮注射大鼠由于自我清洁能力下降，其毛色逐渐发黄，变脏，有掉毛现象，与其余组有明显区别。部分大鼠有轻微口腔出血等现象，另外有大鼠出现肌肉震颤、全身抖动、四肢发僵等类PD症状，随着造模天数增加，上述表现更加明显。假手术组和正常组大鼠皮毛光滑，活泼好动，饮食如常。经电针治疗后，电针组PD大鼠的异常行为明显改善。

2. 2大鼠中脑黑质区TH、p-ERK1/2、TNF-α阳性细胞数变化

模型组TH阳性细胞明显少于其余三组，p-ERK1/2、TNF-α阳性细胞明显多于其余三组，与模型组相比，电针组大鼠黑质区TH阳性细胞明显增多，p-ERK1/2、TNF-α阳性细胞明显减少(P＜0. 05)。见表1。

2. 3大鼠中脑黑质区TH、p-ERK1/2、TNF-α形态学变化TH阳性细胞质呈棕黄色，模型组TH阳性细胞较正常组明显减少，突起较少，染色明显减弱，电针组与模型组差异明显。p-ERK1/2和TNF-α的表达主要在细胞质，正常组大鼠黑质阳性细胞数量较少，胞质着色较浅，而模型组大鼠黑质阳性细胞数量增多，并且胞质染色明显加深，电针组与模型组差异明显。见图1～图3。

表1　各组大鼠中脑黑质区TH、p-ERK1/2、TNF-α阳性细胞数(个/mm2，n=8，x±s)

图1　各组大鼠中脑黑质区组织TH表达(×400)

图2　各组大鼠中脑黑质区组织p-ERK1/2表达(×400)

图3　各组大鼠中脑黑质区组织TNF-α表达(×200)

3　讨论

现今PD的发病机制尚不明确，多数观点认为该病系由遗传和环境因素共同作用所致。在遗传方面，Parkin、PARK5基因的过表达与抑制、细胞内信号转导通路网络的异常激活都可引起DA神经元活性发生改变。而环境因素引起的氧化应激、炎症反应及线粒体功能障碍亦是引起DA神经元死亡的主要原因〔5〕。在众多PD的危险因素中，越来越多证据表明，以小胶质细胞激活为主的脑内炎症与PD的病程发展相关〔6〕。Reale等〔7〕发现PD患者MCP-1、TNF-α、IFN-γ、IL-lβ等因子的表达水平显著增高(P＜0. 01)。本课题组在前期的研究中亦发现〔8〕，电针能够通过抑制黑质区小胶质细胞介导激活的炎症反应，减少炎症介质如TNF-α，IL-1β，IFN-γ的表达，从而增加黑质TH阳性神经元数量，促进DA能神经元恢复，阻止PD病理进程，对PD的症状起到一定的改善作用。

有文献证实〔9〕，ERK1/2大量存在于中枢神经系统，并参与神经组织的各个生理和病理过程。在剖检的PD患者中脑黑质中有明显的p-ERK颗粒聚集，而在正常对照老年组却极少有磷酸化ERK1/2聚集〔10〕。近来有研究发现ERK1/2的活化与PD密切相关，静息状态时ERK1/2位于细胞的胞质内，当被激活后，ERK1/2迅速进行磷酸化反应，以便同时调节其他一些转录因子的活性，如Elk-1、NF-κB、IL-1、c-Jun、c-fos、ATF、AP-1、TNF-α等，使其基因转录改变，进而调节各自蛋白基因表达发生，最终可以引起细胞的物质能量代谢过程和生理生化功能水平的变化，导致特定生物学效应的产生〔11〕。周丹等〔12〕发现在全身炎症过程中，ERK信号通路参与脊髓中细胞信号的转导过程，且主要表达于小胶质细胞，表明ERK这条信号通路参与小胶质细胞的炎症应答过程。赵明等〔13〕的研究发现，ERK1/2通路能被TNF-α强烈激活，通过对转录因子的作用而影响TNF-α的产生和生物学效应。姜勇等〔14〕的研究发现，ERK、p38和JNK三条通路的激活可能参与了脂多糖(LPS)刺激引起的TNF-α启动子转录活性增加机制，它们的协同效应共同发挥了对TNF-α基因表达的调控。本实验结果显示，电针可以降低鱼藤酮诱导的PD模型大鼠中脑黑质内ERK1/2信号通路的表达水平，同时降低炎性因子TNF-α的表达。

综上所述，电针对PD病模型大鼠症状的改善可能与其抑制炎性反应早期大鼠黑质区ERK1/2的磷酸化密切相关，并可能通过抑制ERK1/2的活化达到减少TNF-α的结果。

4参考文献

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11韦强，郭强，王宏磊. ERK1/2在老年病治疗中的研究进展〔J〕．中国老年学杂志，2012; 32(6): 1319-22.

12周丹，沈勤．ERK信号转导通路在LPS诱导的炎症过程中的表达〔A〕．华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编〔C〕，南通: 2008年．

13赵明，刘亚伟，刘爱华，等．细胞信号转导分子在TNF-α诱导c-jun基因表达中的作用〔J〕．生物化学与生物物理学报，2000; 32(3): 59-65.

14姜勇，龚小卫. MAPK信号转导通路对炎症反应的调控〔J〕．生理学报，2000; 52(4): 267-71.

〔2014-05-22修回〕

(编辑袁左鸣)

Effect of electroacupuncture on ERK1/2 signaling pathway of substantia nigra cells of rotenone-induced rats model with Parkinson＇s disease

WANG Shu-Ju，MA Jun，WANG Yan-Chun，et al．
College of Acupuncture＆Orthopedics，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，Hubei，China

【Abstract】Objective To observe the effect of electroacupuncture(EA)on ERK1/2 signaling pathway and inflammatory cytokines TNF-α in substantia nigra(SN)cells of rotenone-induced rats model with Parkinson＇s disease(PD)，and explore the mechanism of EA on PD．Methods A total of 32 male SD rats were randomly and averagely divided into normal，sham-operation，model and EA groups．Model and EA groups were injected intradermally with rotenone(dissolved in DMSO and saline in certain percentage)on the nape of the neck for 14 d to establish PD model rats．Behavioral assessment was conducted after the establishment of PD rats model．EA group was applied to "Fengfu" and "Taichong" points for 20 min once daily for 14 d．Other groups were not given treatments．After the treatments，the rats were killed for sampling substantia nigra tissue to detect the number of TH，p-ERK1/2 and TNF-α positive cells by inmmuno-histochemistry．Results Rats in each group performed differently in neurobehavior．Compared with normal and sham-operation groups，the expressions of TH positive cells were significantly reduced in model group(P＜0．05)，the expressions of p-ERK1/2 and TNF-α positive cells were significantly increased in model group(P＜0．05)．Compared with that of model group，the expression of TH positive cells was significantly increased in EA group(P＜0. 05)，the expressions of p-ERK1/2 and TNF-α positive cells were significantly reduced in EA group(P＜0．05)．Conclusions EA therapy might reduce the expression of TNF-α in SN of PD rats by regulating the expression of p-ERK1/2(MAPK pathway)，which might delay the process of PD．

【Key words】Parkinson＇s disease; Electroacupuncture; MAPK/ERK1/2; TNF-α; Tyrosine hydroxylase

通讯作者:马骏(1964-)，女，教授，博士，主要从事针灸防治脑病及神经系统疾病的研究。

基金项目:国家自然科学基金项目(No．81273863);湖北省自然科学基金计划项目(No．2013CFB066);湖北省教育厅科研项目(No．Q20121608);湖北省教育厅高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目(No．T201308)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5694-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 007

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R749

第一作者:王述菊(1977-)，女，副教授，博士，主要从事针灸防治脑病及神经系统疾病的研究。