成年大鼠重度脊髓损伤后损伤中心不同白质束的病理变化①

裴晓姣，杨朝阳，郝鹏，饶家声，赵璨，李晓光

成年大鼠重度脊髓损伤后损伤中心不同白质束的病理变化①

裴晓姣1，杨朝阳1，郝鹏1，饶家声2，赵璨2，李晓光1

目的研究大鼠重度脊髓损伤后损伤中心不同白质束的病理变化。方法21只成年雌性Wistar大鼠，分为正常对照组(n=3)、假手术组(n=3)和脊髓损伤组(n=15)。损伤组使用NYU脊髓损伤打击器10 g×50 mm制备大鼠T7-8节段重度脊髓损伤模型。损伤后1 d、3 d、7 d、14 d和28 d通过快蓝染色(LFB染色)、NF200免疫组织化学染色检测损伤脊髓的病理改变，旷场Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)法评价大鼠行为学变化。结果大鼠后肢运动功能在损伤后3 d开始自发性恢复，在14～28 d达到平台期。LFB染色显示，损伤中心腹侧束白质和外侧束白质有残留，残留白质面积百分比在损伤后3 d降至最低，7～28 d为平台期。免疫组化染色显示，损伤中心不同白质束中NF200阳性轴突数目在伤后明显减少。结论脊髓损伤后，腹侧白质残留对大鼠后肢运动功能恢复起关键作用，伤后3 d为脊髓损伤急性期保护残留白质的关键时间窗。

脊髓损伤；功能恢复；残留白质；轴突变性

[本文著录格式]裴晓姣，杨朝阳，郝鹏，等.成年大鼠重度脊髓损伤后损伤中心不同白质束的病理变化[J].中国康复理论与实践,2015,21(4):373-377.

CITED AS:Pei XJ,Yang ZY,Hao P,et al.Pathology of white matter tracts at core of severe spinal cord injury in adult rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):373-377.

脊髓损伤多由交通意外事故或高空坠落伤所引发，常导致患者永久性运动障碍、感觉功能缺失以及自主神经功能丧失[1-3]。目前为止，该疾病尚无有效治愈方法。脊髓损伤后的急性期，损伤区会产生一系列继发性损伤，继发性脊髓损伤的机制包括水肿、充血、炎症细胞浸润和细胞毒性[4-7]，这种继发性损伤蔓延至损伤周围白质，造成白质束丢失[8-9]。有研究证实，大鼠脊髓损伤模型中背侧白质完全丢失，外侧白质(lateral white matter,LWM)和腹侧白质(ventral white matter,VWM)大量减少，是导致后肢功能丧失的主要

原因[10-11]。白质束损伤和残留程度对于损伤后后肢运动功能恢复有着关键性意义[1,12]。残留白质(spared white matters,SWM)与功能恢复显著相关[13-14]。本研究探讨脊髓损伤后不同白质束病理变化的时空规律以及残留的不同白质束对运动功能恢复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雌性Wistar大鼠21只，体重180～200 g，SPF级，由首都医科大学实验动物部提供，许可证号：SYXK(京)2013-0004。分为对照组(n=3)、假手术组(n=3)和损伤组(n=15)。

1.2 模型制备

损伤组大鼠6%水合氯醛60 ml/kg腹腔注射麻醉，沿低位胸椎做矢状切口，暴露T7-9椎板与棘突。手术显微镜下去除T8节段椎板，暴露硬脊膜。

将大鼠固定于NYU脊髓打击器底座上，用固定装置夹住T7和T9棘突固定脊柱，使用直径2.5 mm，重10 g的撞击棒从高50 mm处自由落下撞击大鼠脊髓，从坠落到抬起撞击棒持续时间10 s[13]。压迫止血，缝合肌肉、皮肤。

假手术组仅去除椎板，暴露硬脊膜。

术后严密观察精神状态、饮食、排尿、有无肢体水肿及压疮等。术后每天注射青霉素1×105U，共7 d，每天辅助排尿2～3次，直到膀胱恢复自主排尿功能。

1.3 行为学评价

分别于术前以及术后1 d、3 d、7 d、14 d和28 d进行旷场运动测试，将动物置于直径为2 m的圆形平台上，共4 min。采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分[13,15]，由对分组不知情的研究人员进行评分。

1.4 取材

损伤组术后1 d、3 d、7 d、14 d和28 d各取3只大鼠，4%多聚甲醛经心脏固定，取脊髓损伤中心节段，固定过夜，入0.01 mol/L PB 30%蔗糖脱水。脊髓冠状面连续冰冻切片，厚20 μm，-20℃保存。

1.5 快蓝染色(Luxol fast blue,LFB)

切片入1%LFB染液2 h，60℃或37℃过夜，95%酒精洗，蒸馏水清洗后0.05%碳酸锂分化10 s，70%酒精分化至灰白质分辨明显(30～60 s)；充分水洗，镜下见核无色为度。如已过染，返回重复。入0.1%焦油紫(以1%冰醋酸配)37℃染5 min，蒸馏水洗，依次使用70%酒精和95%酒精脱色至尼氏小体呈紫色，中性树胶封片[16-17]。

残留白质百分比=LFB染色面积/总切片面积× 100%

1.6 NF200免疫荧光染色

10%山羊血清封闭30 min，小鼠抗NF200一抗(Abcam,1∶100)4℃冰箱孵育60 h，PBST漂洗后加入Alex488(green)标记的山羊抗鼠荧光二抗IgG(Invitrogen,1∶200)，室温避光孵育8 h。最后加入Hochest33342(SIGMA,1∶3000)，室温避光孵育2 min。50%PB甘油封片，荧光显微镜(Lexical,DP71)下观察并照相。

在背侧白质区(dorsal column white matter,DC)、左外侧白质区(left lateral white matter,LLWM)、右外侧白质区(right lateral white matter,RLWM)、左腹侧白质区(left ventral white matter,LVWM)和右腹侧白质区(right ventral white matter,RVWM)内各选一个正方形(294×294 μm)，高倍镜下(20×)使用IPP软件分别进行NF200阳性计数。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 行为学评价

术前和术后1 d、3 d、7 d、14 d及28 d，大鼠左、右后肢BBB评分无显著性差异(t=0.8154,P= 0.4519)。见图1。

与术前相比，术后1 d大鼠BBB评分显著下降(P＜0.001)。术后1 d和3 d比较无显著性差异(P=0.494)。术后7 d、14 d和28 d与术后1 d比较，BBB评分显著提高(F=286.029,P＜0.001)。术后14～28 d，大鼠后肢BBB评分无显著性差异(P=0.999)。见图2。

2.2 LFB染色

对照组可见LFB染色均匀分布在整个脊髓白质内。损伤急性期，灰质和背侧白质明显丢失，损伤中心形成囊腔，囊腔中充满坏死神经元、轴突和髓鞘残骸。慢性期，囊腔逐渐液化形成空洞，囊腔周边有白质束残留，尤其是腹侧白质束(图3)。

与损伤前相比，DC损伤最严重：术后1 d残留白质低于1%，此后一直处于较低水平。LLWM、RLWM和VWM残留白质百分比随时间变化的趋势相

似，均在术后3 d降至最低，随后逐渐回升。VWM高于LLWM和RLWM。术后7～28 d，腹侧残留白质百分比无显著性差异。见图4。

2.3 NF200免疫荧光染色

对照组NF200阳性轴突以规则方式整齐均匀排列在白质中。损伤组术后1 d，脊髓所有白质束中NF200阳性轴突数目大量丢失；术后3 d，各白质束中可见NF200阳性轴突数目持续减少，以DC丢失最为严重。轴突的丢失以及变性在术后28 d仍可观察到，残留轴突排列紊乱，肿胀断裂。5区域轴突随时间变化的趋势相似。见图5、图6。

图2 损伤组术后不同时间点BBB评分

图3 LF B 染色(Bar:500 μm)

图4 大鼠脊髓损伤前后不同时间点各白质束残留白质百分比

图5 大鼠脊髓损前后不同时间点各白质束NF200阳性轴突数

图6 NF200轴突(DG荧光染色，Bar:100 μm)

3 讨论

3.1 后肢运动功能自发性恢复

术后1 d和3 d，大鼠BBB评分明显下降，后肢表现为软瘫或部分有轻微关节运动，此结果与Basso等[13]和Kim等[18]结果相似。其原因可能是由于脊髓受损后即刻发生脊髓休克，脊髓神经元的正常活动受到破坏，导致损伤早期后肢出现软瘫以及轻微关节运动[18]。术后3～14 d，后肢运动功能明显恢复，也与先前的研究结果一致[18]。

目前普遍认为，重要的运动通路存在于背侧白质束，背侧白质束损伤会造成永久性后肢运动功能丧失。本研究模型造成背侧白质束完全丢失，但未造成严重的运动功能丧失，与Loy等研究结果[19]一致。Loy的研究还证明，腹侧白质和腹外侧白质受损会导致严重运动功能丧失[19]。有研究表明，腹侧白质残留12%～15%者，后肢BBB评分有明显恢复；若残留15%～25%，前后肢运动会有协调性恢复[20-21]。提示自发性恢复的主要原因为残留白质，尤其是腹侧残留白质。

本研究显示，术后14～28 d，BBB评分达到平台期；与之相应，术后7～28 d损伤中心的腹侧残留白质百分比也达到平台期。支持腹侧白质束的残留对运动功能的恢复起到关键性作用。脊髓损伤在28 d后开始进入慢性期，形态学变化以及行为学评分逐渐趋于稳定。

3.2 残留白质

脊髓损伤后的白质丢失是主要的病理特征之一，损伤中心以及周围白质的丢失可能是运动功能丧失的主要潜在原因[22-24]。本研究显示，术后3 d白质丢失最为严重，此后缓慢趋于稳定；而BBB评分同样在术后3 d开始出现恢复迹象。

本研究结果提示，脊髓损伤后3 d是脊髓损伤急

性期病理变化的关键时间点，可能成为降低白质受损的关键时间窗。Scott等通过经颅刺激诱发电位和BBB评分表明，残留白质的数量与运动功能高度正相关[10]。在脊髓损伤急性期治疗中，尽可能早地减轻白质受损程度，有可能最大限度地保留运动功能。

由于大鼠的网状脊髓束广泛分布于脊髓腹侧柱以及腹外侧柱。本研究LFB染色发现，残留白质多数包括网状脊髓束。因此，后肢功能的恢复可能包括网状脊髓束的功能恢复或者重组，这与之前报道一致[10]。

3.3 轴突变性

由于背侧是直接受到撞击的部位，因此术后1 d和3 d可见轴突大量丢失，此部位残留的轴突多数为轴突碎片。LVWM和RVWM距离直接损伤的位置较远，主要受对冲伤影响，轴突丢失相对于DC程度较轻，轴突出现肿胀。术后7 d、14 d和28 d仍存在轴突大量丢失的情况，可能是由于继发性损伤所导致[22,25]。

腹侧白质和外侧白质对于运动功能有着关键作用。本研究结合病理学和行为学探讨损伤中心白质束病理变化的时空规律，发现术后1 d背侧白质几乎完全丢失；术后3 d，腹侧白质和外侧白质损伤严重，7～28 d缓慢趋于稳定，可为脊髓损伤后的治疗时间窗和治疗策略提供参考。

下一步计划结合无创技术如MRI，在体观察脊髓损伤白质病理变化规律，为脊髓损伤早期准确判读损伤程度和运动功能恢复情况提供有用信息。

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Pathology of White Matter Tracts at Core of Severe Spinal Cord Injury inAdult Rats

PEI Xiao-jiao1,YANG Zhao-yang1,HAO Peng1,RAO Jia-sheng2,ZHAO Can2,LI Xiao-guang1
1.Department of Neurobiology,Capital Medical University,Beijing 100069,China;2.Department of Biomedical Engineering,School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China

Objective To explore pathological characteristics of different white matter tracts at core of the spinal cord injury(SCI)in adult rats.Methods 21 adult female Wistar rats were divided into normal group(n=3),sham group(n=3)and lesion group(n=15).The rats of the lesion group were severely injured at T7-8using the NYU impactor of 10 g×50 mm.The pathology of spinal cord injury was detected using Luxol fast blue(LFB)staining and NF200 immunohistochemistry staining 1 day,3 days,7 days,14 days and 28 days after injury, while the hindlimbs behavior of rats was rated with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores of open-field.Results The BBB scores recovered 3 days after injury and reached a platform from 14 to 28 days after injury.LFB showed that there were spared white matters on ventral white matter(VWM)and lateral white matter(LWM).The percentage of spared white matters area decreased to the lowest 3 days after injury,and reached a platform from 7 to 28 days after injury.The number of NF200-IR axons reduced significantly in white matter tracts after SCI.Conclusion Ventral spared white matters plays a key role in the recovery of motor function in rat with SCI,and the first 3 days was a time window to protect the white matters from injury.

spinal cord injury;function recovery;spared white matter;axon degeneration

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.001

R651.2

A

1006-9771(2015)04-0373-05

2015-01-18

2015-02-03)

1.“十二五”国家科技支撑计划项目(No.2012BAI17B04)；2.国家“863”计划项目(No.2012AA020506)。

1.首都医科大学神经生物学系，北京市100069；2.北京航空航天大学生物医学工程学院，北京市100191。作者简介：裴晓姣(1987-)，女，山西太原市人，硕士研究生，主要研究方向：结合MRI研究脊髓损伤神经纤维及胶质瘢痕形成的病理变化。通讯作者：李晓光(1959-)，男，汉族，吉林长春市人，博士，教授，主要研究方向：应用组织工程学方法修复神经系统损伤的研究。E-mail:lxgwelcome@263.net。