碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞向神经元分化并形成突触的研究①

王聪，杨朝阳，段红梅，李晓光

碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞向神经元分化并形成突触的研究①

王聪1，杨朝阳1，段红梅2，李晓光1

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-壳聚糖载体对神经干细胞(NSCs)的诱导分化作用。方法原代培养新生24 h Wistar大鼠脊髓NSCs，纯化后分别向培养基加入单纯壳聚糖、单纯bFGF和bFGF-壳聚糖载体。3 d后，行Nestin和β-微管蛋白Ⅲ免疫荧光染色；7 d后，行微管相关蛋白2(MAP2)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色；14 d后，行synapsin-1和MAP2免疫荧光染色，并利用MED64平面微电极阵列记录系统检测分化后神经元的电生理活性。结果培养3 d后，各组均可见Nestin+/β-微管蛋白Ⅲ+细胞，bFGF-壳聚糖载体诱导的细胞神经丝长度大于其他两组；7 d后，各组均可见MAP2+、GFAP+和MBP+细胞，bFGF-壳聚糖载体诱导的细胞MAP2+比例高于其他两组；14 d后，bFGF-壳聚糖载体诱导的细胞呈synapsin-1+/MAP2+，且有自发放电现象。结论bFGF-壳聚糖载体诱导NSCs高比例向神经元分化，且分化而成的神经元之间形成突触，并具有电生理活性。

神经干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；壳聚糖；神经分化；突触；神经元

[本文著录格式]王聪，杨朝阳，段红梅，等.碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞向神经元分化并形成突触的研究[J].中国康复理论与实践,2015,21(4):406-411.

CITED AS:Wang C,Yang ZY,Duan HM,et al.Basic fibroblast growth factor-chitosan carriers induce neural stem cells to differentiate into neurons and form synapses[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):406-411.

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是来源于神经系统，具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞群落[1]，最初由Reynolds和Richards于1992年从成年鼠的纹状体和海马中分离得到。之后的研究表明，成年动物内源性NSCs主要位于海马齿状回颗粒细胞下层[2](subgranular zone,SGZ)、侧脑室脑室下区[2](subventricular zone,SVZ)、脊髓中央管室管膜区[3](central canal,CC)。最近报道，将NSCs移植入受损的中枢神经系统(central nervous system,CNS)可以修复受损组织的结构和功能[4]。因此，NSCs移植成为治疗CNS疾病，如脑外伤[5]、脊髓损伤[6]、脑卒中[7]和神经退行性疾病[8]等颇具前景的方法。

NSCs修复损伤CNS的机制可能为其营养作用或分化为成熟神经网络[9]，故诱导NSCs分化为成熟神经网络的研究成为近年来研究的热点。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，即FGF-2，是FGF家族的一员，具有促进神经组织生长发育、血管生成、创伤愈合和组织修复等作用[10-11]。壳聚糖是一种可降解、无细胞毒性、价格低廉的生物活性材料。神经营养因子-壳聚糖载体可以缓慢释放神经营养因子，延长神经营养因子作用时间；作为生物支架，为细胞增殖、迁移和分化提供支持和促进作用[12]。

本研究利用bFGF-壳聚糖载体诱导NSCs向神经元分化，并检测分化的神经元是否形成有电生理活性的突触。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只新生24 h内Wistar大鼠，SPF级，首都医科大学实验动物部提供，许可证号：SYXK(京) 2013-0004。

1.2 实验方法

1.2.1 NSCs的分离培养和鉴定

新生24 h内Wistar大鼠，冰冻麻醉，75%酒精中浸泡1 min消毒，于超净台(上海BOXUN净化设备公司)剪开背部皮肤，暴露脊柱，吹出脊髓，置D-hanks液(GIBCO)中清洗3次。解剖显微镜(OLYMPUS)下剥离硬脊膜，剪碎脊髓，吸管轻轻吹打为单细胞悬液，以1×105细胞/cm2的浓度种植在含有新鲜培养基的培养瓶(COSTAR)中。培养基成分(体积比)：96.8% DMEM/F12(GIBCO)、2%B27(INVITROGEN)、0.1%bFGF(20 ng/ml,SIGMA)、0.1%EGF(20 ng/ml, SIGMA)和1%青链霉素(SIGMA)。

细胞置5%CO2培养箱(SANYO)中37℃培养。每2～3天半量换液1次。细胞悬液1000 r/min离心5 min (TDZ-4WS长沙湘仪离心机厂)，弃去1/2培养基，细胞沉淀吹打混匀，再加入等量新鲜培养基。1周左右形成NSC球时传代。0.25%胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)消化，以1×105细胞/cm2的浓度种植在含有新鲜培养基的培养瓶中。P3～P4时，B1X71相差倒置显微镜(OLYMPUS)下观察神经球形态，Nestin免疫荧光染色鉴定细胞纯度。

1.2.2 NSCs的诱导分化

取P3～P4 NSCs球，以350球/cm2的密度中种植于包被有左旋多聚赖氨酸(SIGMA)的盖玻片上。单纯壳聚糖组向培养基中加入10 mg/ml壳聚糖(SIGMA)，单纯bFGF组向培养基中加入20 ng/ml bFGF(SIGMA)，bFGF-壳聚糖载体组向培养基中加入10 mg/ml bFGF-壳聚糖载体。每2～3天半量换液1次。

1.2.3 免疫荧光

诱导后3 d，行Nestin和β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)免疫双标记染色；诱导后7 d，行微管相关蛋白2 (microtubule-associated protein-2,MAP2)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)染色；诱导后14 d，行synapsin-1和MAP2免疫双标染色。

免疫荧光染色过程如下。4%多聚甲醛4℃固定40 min，0.3%TritonX-100破膜5 min，1%NGS室温封闭30 min，加入相应一抗，37℃孵育2 h，加入Alexa594和Alexa488标记的山羊抗兔或小鼠荧光二抗(1∶300，INVITROGEN)，37℃避光孵育1 h，Hoechst 33342(1∶1500,SIGMA)复染核，50%PB甘油封片，BX51荧光显微镜(OLYMPUS)下观察照相。

以上实验所用一抗和稀释比例如下：小鼠抗Nestin单克隆抗体，1∶100，MILLIPORE)；兔抗-β-tubulinⅢ多克隆抗体，1∶200，MILLIPORE；小鼠抗MAP2单克隆抗体，1∶250，SIGMA；兔抗GFAP多克隆抗体，1∶100，中杉金桥生物技术有限公司；小鼠抗MBP单克隆抗体，1∶300，ABCAM；兔抗SynapsinⅠ单克隆抗体，1∶100，CELL SIGNALING TECHNOLOGY。

1.2.4 图像分析

诱导后3 d，使用DPcontroler软件随机拍照，使用Image-Pro Plus 6.1软件测量神经球10个最长突起的

长度，每组细胞测10个神经球。诱导后7 d，免疫荧光染色后，使用DPcontroler软件拍照，使用Image-Proplus 6.1软件随机选取20个视野，分别计数MAP2+、GFAP+和MBP+细胞数。

1.2.5 细胞电生理

采用MED64平面微电极阵列记录系统(ALPHA MED SCIENCE)。电极浸泡于75%酒精中30 min，紫外照射30 min。MED Probe培养槽中加0.01%无菌左旋多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,SIGMA)1 ml，4℃冰箱包被1周。将内径为5 mm的硅胶环置于64个电极所在的MED Probe中心区，取P3～P4的NSCs球，350球/cm2的密度种植到此区域，5%CO2培养箱中37℃培养6～8 h。移除硅胶环，加入新鲜NSCs细胞培养基1 ml，隔天换液一次。14 d后，将MED Probe置于MED connector上，打开软件，设定参数，检查噪声，观察多个神经元的自发放电现象。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NSCs原代培养和传代生长情况

接种24 h后，NSCs多为单细胞状态，只出现8～10个小的神经球。随着细胞增殖，球体慢慢增大，细胞碎片减少。传代后，细胞增殖迅速，球体增大，细胞边界清楚，折光性强，且最外层细胞伸出毛刺样突起。见图1。

2.2 分化为幼稚神经元

诱导3 d后，所有NSCs均分化为Nestin+/β-tubulinⅢ+的幼稚神经元。见图2。bFGF-壳聚糖载体组神经丝长度为(272.5±34.786)μm，显著大于单纯壳聚糖组(40.75±3.305)μm和单纯bFGF组的(60.375±3.898)μm (F=39.901,P＜0.001)。

2.3 分化为神经元

诱导后7 d，各组均可见MAP2+、GFAP+和MBP+细胞。见图3。bFGF-壳聚糖载体组MAP2+细胞占(82± 1.528)%，高于单纯壳聚糖组的(41±1.223)%和单纯bFGF组的(50±1.316)%(F=17.925,P=0.003)。

2.4 突触形成

突触形成是神经元发育成熟的标志[13]。诱导后14 d，bFGF-壳聚糖载体可在MAP2+神经元胞体和突起上观察到Synapsin-1+轴突终末，呈点状分布，神经元间形成轴-体和轴-树突触。见图4。

2.5 电生理活性

bFGF-壳聚糖载体诱导14 d后，约50%电极点记录到神经元峰电位信号。见图5。

图2 诱导后3 d NSCs分化情况

图3 诱导后7 d NSCs分化情况

图4 诱导14 d bFGF-壳聚糖载体组分化情况

图5 神经元的自发放电

3 讨论

CNS损伤后的修复和再生一直是尚未解决的世界性难题。NSCs植入损伤区修复CNS成为近年来研究的热点。本实验建立了体外NSCs诱导分化模型，向纯化的NSCs中加入适量的bFGF-壳聚糖载体后，可诱导NSCs分化为成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。且随着神经元的逐渐成熟，分化神经元之间能够形成突触联系，并具有电生理活性。

壳聚糖由几丁质经过脱乙酰作用得到，具有良好的生物相容性，且能被生物体内的溶菌酶降解，具有无毒和可被生物体完全吸收的特点。因此将壳聚糖作为药物缓释系统具有极大的优势[14-15]。

bFGF是重要的促有丝分裂因子[16]，具有诱导细胞形态发生和分化，促进神经外胚层来源细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞和神经细胞等存活与生长的特点[17-18]。但bFGF在体内的半衰期短，单独存在时易被降解，且价格昂贵。本实验使用壳聚糖作为细胞因子载体，能够缓慢可控地释放bFGF，极大提高其生物性能[19]。结果证实，bFGF-壳聚糖载体能够在体外诱导NSCs高比例分化为成熟神经元。

神经细胞间的突触联系是神经元信息交流和神经系统执行功能的基础。通常一个神经元的轴突终末与多个神经元胞体或树突形成突触联系，组成神经网络，接受、整合、传导和输出信息，实现细胞间的信息交换[20-21]。诱导分化的神经元之间能够形成突触是诱导方案的关键。本实验通过突触前后标记物的免疫

荧光双标记证明，bFGF-壳聚糖载体诱导分化的神经元间可形成轴-体和轴-树突触。

MED64是一种多通道微电极阵列离体记录系统，可以将急性脑片[22]、脊髓片[23]置于或分离培养的细胞[24]直接培养于分布有64个微电极的培养皿内。与膜片钳技术相比，MED64可以在同一时间获取64个位点的电生理信号，且有对细胞非侵入、无损害等优点[25]。本实验应用MED64观察到，经bFGF-壳聚糖载体诱导分化而成的神经元可自发放电。

总之，本实验证明，bFGF-壳聚糖载体可诱导NSCs高比例分化为成熟、具有电生理活性的神经元，且神经元间可形成突触联系。但是，该神经元为何种类型神经元，神经元之间形成的突触为兴奋性突触还是抑制性突触，诱导NSCs分化的分子机制，以及该复合生物活性材料(NSCs-bFGF-壳聚糖)能否体内修复神经系统损伤等，均需进一步探讨和研究。

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Basic Fibroblast Growth Factor-Chitosan Carriers Induce Neural Stem Cells to Differentiate into Neurons and Form Synapses

WANG Cong1,YANG Zhao-yang1,DUAN Hong-mei2,LI Xiao-guang1
1.Department of Neurobiology,Capital Medical University,Beijing 100069,China;2.Department of Biomedical Engineering,School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China

Objective To explore the effect of basic fibroblast growth factor(bFGF)-chitosan carriers on neural differentiation of neural stem cells(NSCs).Methods NSCs were isolated from spinal cord of a neonatal Wistar rat and cultured.Purity of cultured NSCs was identified with Nestin immunofluorescent staining.The 10 mg/ml chitosan carriers,20 ng/ml bFGF or 10 mg/ml bFGF-chitosan carriers were added into medium of P3～P4 NSCs respectively.NSCs were observed with immunofluorescent staining:3 days after incubation with Nestin and β-tubulin III;7 days after incubation with microtubule-associated protein-2(MAP2),glial fibrillary acidic protein(GFAP)and myelin basic protein(MBP);and 14 days after incubation with synapsin-1 and MAP2.The electrophysiological activity of cells was detected with MED64.Results 3 days after incubation,all the NSCs differentiated into Nestin+/β-tubulin III+,and the length of neurofilament was the highest in those co-cultured with bFGF-chitosan carriers.7 days after incubation,NSCs differentiated into MAP2+,GFAP+and MBP+,and more NSCs differentiated into MAP2+with bFGF-chitosan carriers.14 days after incubation,NSCs differentiated with bFGF-chitosan carriers express synapsin-1+/MAP2+and showed electrophysiological activity.Conclusion bFGF-chitosan carriers can induce NSCs to differentiate into neuron with high percentage and the differentiated neurons can form synapses with electrophysiology activity.

neural stem cells;basic fibroblast growth factor;chitosan;neural differentiation;synapses;neurons

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.009

R741.05

A

1006-9771(2015)04-0406-06

2015-01-14

2015-02-10)

1.国家自然科学基金面上项目(No.31271037)；2.国家自然科学基金国际合作与交流项目(No.31320103903)。

1.首都医科大学神经生物学系，北京市100069；2.北京航空航天大学生物医学工程学院，北京市100191。作者简介：王聪(1988-)，女，河北辛集市人，硕士研究生，主要研究方向：神经干细胞诱导分化的研究。通讯作者：李晓光(1959-)，男，汉族，吉林长春市人，博士，教授，主要研究方向：应用组织工程学方法修复神经系统损伤的研究。E-mail:lxgwelcome@263.net。