10%硫软膏微生物限度检查的方法验证

陈 菡

(安徽省食品药品审评认证中心，安徽合肥 230051)

硫软膏为医院常用的自配外用制剂，用于疥疮、痤疮、脂溢性皮炎、酒渣鼻、单纯糠疹和慢性湿疹、神经性皮炎、银屑病、头癣、体癣、手足癣。硫软膏在中国药典、美国药典、英国药典、欧洲药典里均尚未给出具体的微生物检查方法，但是由于硫软膏用于皮肤上，其带有的微生物可以通过受损的皮肤进行感染，故要求微生物控制在一定的范围内［1－3］。本文按照2010年版的《中国药典》附录提供的方法，对10%硫软膏进行微生物限度检查进行方法验证，以寻求最佳的检查方法，为制剂的质量提供依据。

1 实验材料

1.1 药品和培养基 硫软膏(10%)(合肥市皮肤病防治研究所，批号:111012)溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号:100128)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号:0909152)、营养肉汤培养基(批号:101122)、营养琼脂培养基 (批号:101126)、胆盐乳糖培养基(批号:110406)、改良马丁培养基(批号:1103232)、pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液(批号:1007072)、改良马丁琼脂培养基(批号:101027)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号:100129)。以上培养基均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 菌株 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC(B)26 003)、大肠埃希菌(Escherichia coli)(CMCC(B)44 102)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(CMCC(B)10 104)、黑曲霉(Aspergillus niger)(CMCC(F)98 003)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(CMCC(B)63 501)、白色念珠菌(Candida albicans)(CMCC(F)98 001)的二代冻存管购自合肥市药品检验所。

1.3 仪器 PYX-DHS-40×50型隔水式电热恒温细菌培养箱(上海跃进医疗器械厂)、ML160型霉菌培养箱(上海跃进医疗器械厂)、立式灭菌器(上海申安医疗器械产)。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

2.1.1 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 接种新鲜培养物于营养肉汤培养基中培养18～24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成50 ～100 cfu·mL－1菌悬液。

2.1.2 白色念珠菌 接种新鲜培养物于改良马丁培养基中培养24～48 h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成50 ～100 cfu·mL－1菌悬液。

2.1.3 黑曲霉 接种新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基中培养5～7 d，向其中加入含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液3～5 mL，将孢子洗脱，吸取孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(mL·mL－1)吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每50 ～100 cfu·mL－1孢子悬液。

2.2 供试液的制备 将供试品10 g加入含20 mL无菌十四烷酸异丙酯(由国药集团化学试剂有限公司提供，批号:F20110325)和无菌玻璃珠容器中，充分振摇溶解，加入100 mL的45℃的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，振摇5～10 min，萃取，水层作为1∶10供试液。

2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证 确定检查方法后，进行至少3次独立的平行验证试验，计算各试验菌每次试验的回收率。

试验组:分别取 1、0.5、0.2、0.1 mL 的 1∶10 供试液，与1 mL试验菌液注入同一平皿中，注入相应的琼脂培养基，待凝，倒置培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

菌液组:取试验菌液1 mL注入平皿中，注入相应琼脂培养，待凝，倒置培养，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

对照组:分别取 1、0.5、0.2、0.1 mL 的 1∶10 供试液，根据试验组方法，在不加菌液的条件下测定样品本底菌。计算各试验菌株的回收率。

计算方法如下:

对照组回收率=对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%

试验组回收率=(试验组平均菌落数－对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%

结果判定:对照组的菌回收率应大于或等于70%。当试验组均不低于70%时，供试品的细菌、霉菌及酵母菌数可根据供试液制备方法和菌落计数法测定;否则，应建立新的方法，进行重新验证。本实验结果见表1。

表1 第一次实验试验结果/CFU·mL－1

通过表1可以看出，利用常规法(每皿1 mL)所得的回收率结果都大于70%。但是枯草芽孢菌的回收率明显比其他的菌株低，说明供试液对枯草芽孢菌还有一定的杀菌作用。另外可以看出的是采用每皿0.2 mL以及每皿0.1 mL的稀释方式所得的回收率比较高，说明采用培养基稀释法对回收率的影响不大，药品制剂中的抑菌成分能得到很好的控制，使其产生很少或者不产生抑菌作用。

2.4 控制菌检查方法的验证

2.4.1 菌种选择 由于10%硫软膏为局部的给药制剂，所以要进行控制菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查。

2.4.2 金黄色葡萄球菌检查方法的验证 试验组取10 mL的1∶10供试液和1 mL金黄色葡萄球菌菌液加入100、200及500 mL的营养肉汤增菌培养基中，按金黄色葡萄球菌的检查法中国药典(二部)(附录A)进行检查。结果见表2。

2.4.3 铜绿假单胞菌检查法的验证 试验组取1∶10供试液10 mL及1 mL铜绿假单胞菌菌液加入100 mL的胆盐乳糖增菌培养基中，按铜绿假单胞菌的检查法进行检查中国药典(二部)(附录B)。结果见表2。

表2 控制菌验证结果

从表2看出，培养基中均有菌落形成，为了进一步确认所生成的菌落为金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌，对其进行确证实验，方法如下。

取上述加入了铜绿假单胞菌的供试液划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24 h;取加入了金黄色葡萄球菌的供试液划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72 h。其所得结果如表3。

根据《中国药典》2010年版二部的结果比较，菌落形态与其所对应的菌种的菌落特征对应，根据表2，可以确定试验组均能检出金黄色葡萄球菌或者铜绿假单胞菌，运用常规法即可消除对这两控制菌的抑菌作用，对于菌落的生成影响不大，方法成立。运用常规法即可应用于控制菌的检查。

表3 平板菌落形成形态

3 重复试验

3.1 细菌、霉菌及酵母菌计数 采用平行操作，检查两批不同药品进行验证。操作方法与第一次验证试验相同，所得的结果如表4与表5。

从第二次与第三次的重复试验可以看出，采用2010年版的方法制备的供试液对于其中的抑菌活性出去比较彻底，菌的回收率都比较高，都能达到70%以上。故采用常规法即可进行该制剂微生物限度检查。

3.2 控制菌检查方法的重复试验 根据第一次试验的方法进行重复试验，由于第一次试验得到的三种培养基稀释法结论为方法成立，故后两次试验可以不用对采用500 mL的培养基稀释方法进行验证，只要确保200 mL的培养基稀释法方法成立即可。两次试验得到结果证实采用常规法即可进行控制菌检查，方法成立。综合三次试验的结果，可以得到结论:采用常规法进行控制菌的检查方法成立，该方法简单，易于进行，适用范围广，为10%硫软膏的控制菌检查提供了一个可参考的简单方法。对于医院制剂来说，常规法能够降低检查的复杂度，更方便于医院自制制剂的检查。用此方法能够降低检查费用与检查的时间，提高检查的效率。

4 讨论

由于在加入供试液后再加入试验菌的菌悬液时未注入培养基，菌悬液与高浓度供试液可能未完全混合，会影响菌悬液中活菌［4］，因此培养基要尽快注入。

10%硫软膏具有抑菌作用，试验中除去其抑菌作用是关键。因其本身具有抑菌作用，对菌群造成损伤，容易会给结果带来假阴性［5］，造成菌回收率的下降。在试验中可采取培养基稀释法进行验证，如果方法不成立，应该寻求其他的方法如离心法和薄膜过滤法对抑菌物的除去，这样才能得到更加准确、可靠的结果。

10%硫软膏为难溶于水的固体制剂，在制备其供试液时，加入了十四烷酸异丙酯，故必须设置稀释剂对照组来评价供试液制备方法对微生物的影响程度［6］。

表4 第二次微生物检查试验方法结果

表5 第三次微生物检查试验方法结果

［1］国 明，祝清芬，郑力真.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析［J］.中国药品标准，2008，9(1):46－49.

［2］国家药典委员会.中国药典(二部)［S］.北京:中国医药科技版社，2010:附录 XIJ.

［3］吕会成.药品生物测定的发展趋势［J］.中华现代临床医学杂志，2006，15(4):1360 －1362.

［4］潘 强.六种药微生物限度检验方法验证［J］.中国药品标准，2010，47(1):44 －47.

［5］马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册［M］.北京:科学出版社，2001:55.