双色荧光定量检测大米中的汞

翟 琨，王联芝，向东山,*

（1.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000）

双色荧光定量检测大米中的汞

翟 琨1,2，王联芝2，向东山1,2,*

（1.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000）

利用两条部分互补的富含胸腺嘧啶（T碱基）的单链核酸，结合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ，采用同步荧光分析法，建立一种高灵敏度、高选择性的汞离子（Hg2+）双色荧光定量检测方法。在优化条件下，Hg2+浓度在5×10—10～500×10—10mol/L之间时，SYBR GreenⅠ及Carboxy-X-rhodamine（ROX）总的荧光强度（ΔIT）与Hg2+浓度（C）之间具有良好的线性关系，其拟合的回归方程为∆IT= 2.121 3C+10.536 0，方法检出限（3σ）为2×10—10mol/L。该方法操作简单、检测速度快、选择性好、灵敏度高、重复性好、检出限低。将该方法应用于大米中汞的检测，获得了满意的结果。

汞；定量检测；双色荧光；大米

汞是一种对人体健康有严重危害的金属元素，在人体中具有累积效应[1-2]。汞摄入量过多会影响人体的生殖和发育，有致畸、致癌、致突变作用，严重的还会产生精神异常，极大地危害人体健康[3-7]。因此，汞的定量检测在食品领域中具有十分重要的意义。

目前，汞常用的定量检测方法有紫外-可见光分光光度法[8]、原子发射光谱法[9]、原子吸收分光光度法[10]、原子荧光法[11]、高效液相色谱法[12]及电感耦合等离子体质谱法[13]等。在这些分析方法中，紫外-可见光分光光度法实验设备简单、检测方便且具有较高的检测灵敏度，但该方法显色反应时间长，汞离子显色剂的特异性不高，样品中存在与汞离子化学性质相近的重金属离子时误差较大；原子发射光谱法具有较好的选择性，较低的检出限、极小的基体效应、较高的精密度及广泛的测量范围等特点，但对仪器和精度要求较高，设备造价昂贵，而且不能进行即时测量；原子吸收分光光度法是目前最常用的汞的检测方法，特别是冷原子吸收法现已成为国家标准方法，但该方法对样品制备要求较高，所用时间长，对设备要求较高；原子荧光法具有谱线简单、灵敏度高、干扰少、检出限低等优点，但检测时产生汞蒸气，对操作人员的健康具有一定的威胁；高效液相色谱法及电感耦合等离子体质谱法具有灵敏度高、选择性好的特点，但所需仪器价格昂贵，在多数实验室中的推广应用受到限制。

氧化石墨烯是一种性能优异的新型碳材料，比表面积较大，且表面具有丰富的官能团[14-16]。研究表明，氧化石墨烯对单链核酸具有很强的吸附能力，但对双链核酸的吸附能力很弱[17-18]。另外，氧化石墨烯对荧光染料具有极高的猝灭作用，且猝灭范围很广[19-20]。

核酸染料SYBR GreenⅠ是一种不对称的菁类核酸染料，它本身的荧光信号很弱，与单链DNA也几乎不发生作用，但它与双链DNA有很强的亲和性，且与双链DNA结合后，其荧光强度会增加800～1 000 倍，是目前所发现的最灵敏的核酸染料之一[21]。

基于此，本实验利用T碱基与Hg2+能特异性结合形成稳定“T-Hg2+-T”结构的特点[22]，设计了两条部分互补的富含T碱基的单链DNA（其中一条用荧光染料Carboxy-X-rhodamine（ROX）标记），并结合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ，建立了一种高灵敏的Hg2+双色荧光定量检测方法，并将其应用于大米分析中。

与以前报道的分析方法相比，这种方法不仅具有很高的选择性，而且可以显著地提高检测的灵敏度，降低Hg2+的检出限。该方法操作简单、检测速度快、选择性好、灵敏度高、重复性好、检出限低。将该方法应用于大米中汞的检测，获得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米 益海粮油工业有限公司。

氧化石墨烯 中科碳纳米科技有限公司；SYBR Green Ⅰ购于上海瑞安生物技术有限公司，原始溶液为无水二甲基亚砜制备的10 000倍浓缩液，工作液是浓缩液用超纯水1∶10 000稀释得到；Hg(NO3)2及其他所有化学试剂均为分析纯均购自美国Sigma公司和国药集团化学试剂有限公司；Tris-HCl缓冲溶液由0.1 mol/L Tris通过0.1 mol/L HCl调节得到。两种单链核酸均由上海生工生物工程技术服务有限公司（中国）合成并用高效液相色谱法进行纯化，其核苷酸序列如下：核酸序列Ⅰ（P1）：5’- CTG CTT GCT C -3’；核酸序列Ⅱ（C1）：5’-GAG CTT GCT G-(CH2)6-ROX-3’。

1.2 仪器与设备

RF-5301PC型荧光光谱仪、PB-21型pH计 日本Shimadzu公司；AFS-922型原子荧光光度计 北京吉天仪器有限公司；Ethos Plus型微波消解系统 意大利Milestone公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将两种富含T碱基的单链核酸分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，并配制成5×10—7mol/L的溶液。取50 μL 5×10—7mol/L的P1溶液加入到50 μL 5× 10—7mol/L的C1溶液中并混合均匀，再加入50 μL不同浓度的Hg(NO3)2溶液，并加入缓冲溶液至总体积达到390 μL，在35 ℃孵育10 min后，冷却至室温，加入100 μL SYBR GreenⅠ工作液并在室温条件下反应10 min后，再加入10 μL 0.5 mg/mL的氧化石墨烯，孵育3 min，最后对ROX及SYBR GreenⅠ的荧光信号进行检测。在条件优化时，两种单链核酸的浓度均为5× 10—8mol/L，Hg2+的浓度为5×10—8mol/L，两种单链DNA与Hg2+孵育温度为35 ℃，孵育时间为10 min。

大米样品的消化条件：准确称取0.50 g样品，置于聚四氟乙烯的消解罐中，加人6 mL硝酸和4 mL双氧水（H2O2），密封后将消解罐放入微波中加热，升温程序为100 ℃保持30 min，140 ℃保持25 min，180 ℃保持25 min，样品消解完全后自然冷至室温。将样品消解液转移至100 mL容量瓶中，用1%的硝酸溶液定容，摇匀待测。

1.3.2 Hg2+的检测

Hg2+的测定通过对ROX及SYBR GreenⅠ荧光信号的检测实现。SYBR GreenⅠ最大激发波长为499 nm，最大发射波长为523 nm，波长间隔（Δλ）为24 nm；ROX的最大激发波长为588 nm，最大发射波长为610 nm，Δλ为22 nm。这两种染料的波长间隔较小，但很接近，为了消除反射及瑞利散射对荧光信号的干扰，采用同步扫描荧光光谱法进行分析。该实验中同步扫描的波长间隔设置为23 nm，荧光分光光度计的激发及发射狭缝宽度均设置为10 nm。

2 结果与分析

2.1 检测原理

利用两条部分互补的富含T碱基的单链DNA（其中一条用荧光染料ROX标记）、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）及核酸染料SYBR GreenⅠ对Hg2+检测的原理如图1所示。在没有Hg2+时，两条单链核酸中有多个T-T错配碱基，不能形成双螺旋结构，核酸染料SYBR GreenⅠ与核酸的作用很微弱，其荧光信号很弱。当加入氧化石墨烯时，两种单链DNA均被氧化石墨烯吸附，荧光染料ROX的荧光被猝灭，荧光信号也很弱。在有Hg2+时，两条单链核酸通过“T-Hg2+-T”特异性结合形成双螺旋结构，与SYBR GreenⅠ的作用增强，SYBR GreenⅠ的荧光信号显著增强；当加入氧化石墨烯时，双链核酸不能被氧化石墨烯吸附，ROX的荧光不能被猝灭，因此其荧光信号也会显著增强。利用Hg2+存在时，SYBR GreenⅠ及ROX的荧光信号都显著增强的原理，即可实现Hg2+的双色荧光定量检测。

图 1 检测原理图Fig.1 Mechanism for mercury detection

2.2 方法可行性分析

Hg2+浓度不同时SYBR GreenⅠ及ROX所对应的同步扫描荧光光谱见图2。在没有Hg2+存在时，SYBR GreenⅠ及ROX的荧光信号都很弱（图2a）；当溶液中加入Hg2+后，SYBR GreenⅠ及ROX的荧光信号都显著增强，且Hg2+浓度不同时，它们所对应的荧光信号都有显著的区别（图2b、c）。由此说明，利用上述原理对Hg2+的双色定量检测是可行的。

图 2 Hg 2 Hg2+浓度不同时SYBR GreenⅠ（左）及ROX（右）X对应的同步扫描光谱图Fig.2 Synchronous scanning fluorescence spectra of SYBR GreenⅠ(left) and ROX (right) for different concentrations of Hg2＋

2.3 pH值对测定结果的影响

图 3 pH值对荧光强度的影响Fig.3 Effect of pH on the fl uorescence intensity

缓冲溶液的pH值可以影响两种单链DNA与Hg2+形成双螺旋结构，也可以直接影响核酸染料SYBR GreenⅠ及荧光染料ROX的荧光强度。本实验以Tris-HCl作为缓冲溶液，考察不同pH值的Tris-HCl缓冲溶液对测定结果的影响。结果（图3）表明，在pH值为7.0～9.0的范围内，两种荧光染料的荧光强度都是先增加，然后又降低。在pH值等于8.2时效果最好，因此本实验选择缓冲溶液的pH值为8.2。

2.4 反应温度对测定结果的影响

反应温度是影响两种单链DNA与Hg2+形成双螺旋结构的重要因素之一，温度太低，反应速度慢，而反应温度超过双链的解旋温度，双螺旋结构则不能形成。本实验对不同的反应温度进行考察。结果（图4）表明，反应温度在25～35 ℃之间时，SYBR GreenⅠ及ROX的荧光强度都随着温度的升高而增加；当温度超过35 ℃后，两种染料的荧光强度均快速下降。这主要是因为本实验所设计的两种单链与Hg2+形成的双链解旋温度在38 ℃左右，当温度超过35 ℃后，有部分双链发生解旋形成单链所造成的。因此，本实验选择的最佳反应温度为35 ℃。

图 4 反应温度对荧光强度的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on the fl uorescence intensity

2.5 反应时间对测定结果的影响

反应时间也是影响两种单链DNA与Hg2+形成双螺旋结构的重要因素之一，本实验对不同的反应时间进行考察。结果（图5）表明，反应时间在2～10 min内，SYBR GreenⅠ及ROX的荧光强度均随着反应时间的延长而增加，当反应时间超过10 min时，荧光强度趋于稳定，说明反应在10 min内即可完成。因此，本实验选择的反应时间为10 min。

图 5 反应时间对荧光强度的影响Fig.5 Effect of reaction time on the fl uorescence intensity

2.6 离子强度对测定结果的影响

离子具有稳定双链DNA的作用。本实验通过加入不同浓度的NaCl考察离子强度对荧光强度的影响。结果（图6）表明，NaCl浓度在0～20 mmol/L之间时，SYBR GreenⅠ及ROX的荧光强度均随着NaCl浓度的增加而增加。当NaCl浓度达到20 mmol/L后，其荧光强度趋于稳定。本实验选择NaCl浓度为20 mmol/L。2.7 工作曲线及检出限

图 6 离子强度对荧光强度的影响Fig.6 Effect of ionic strength on the fl uorescence intensity

在最优实验条件下，对Hg2+的浓度与相应SYBR GreenⅠ及ROX的荧光强度之间的关系进行考察。结果（图7）表明，在Hg2+浓度为5×10—10～500× 10—10mol/L之间时，SYBR GreenⅠ及ROX总的荧光强度∆IT（ΔIT=ΔI1+ΔI2，I1为SYBR GreenⅠ的荧光强度，I2为ROX的荧光强度；ΔI = I—I0，I0和I分别表示有Hg2+和没有Hg2+时的荧光强度）与Hg2+浓度（C）之间具有良好的线性关系。其拟合的回归方程为ΔIT= 2.121 3C+ 10.536 0（R2= 0.998 6）。对9 个浓度为5×10—9mol/L 的平行样品分别进行检测以评价方法的精密度，9个检测结果的相对标准偏差为4.43%，说明方法具有良好的精密度。用空白试剂标准偏差（n=11）的3倍除以回归方程的斜率得方法的检出限为2×10—10mol/L。

图 7 工作曲线Fig.7 Calibration curve

2.8 干扰实验

按照检测Hg2+的实验方法，考察大米中常见的金属离子Ca（Ⅱ）、Mg（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Al（Ⅲ）、K（Ⅰ）、Na（Ⅰ）、Ni（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）及Cr（Ⅲ）对Hg2+测定的干扰。结果（图8）表明，在其他金属离子浓度为Hg2+浓度100倍的情况下（Hg2+的浓度为5×10—8mol/L，其他金属离子的浓度为5×10—6mol/L），Hg2+所对应的两种荧光染料的荧光强度还是远大于其他金属离子，这表明该方法对大米中Hg2+的检测具有很高的选择性。2.9 与原子荧光法测定结果的比较及其应用

在不含Hg2+的大米中加入已知量的Hg(NO3)2，样品经消化后分别用本方法和原子荧光法测定Hg2+的含量，结果如表1所示。可以看出，2 种方法测定结果基本相同。本方法应用于加入大米中Hg(NO3)2的检测，结果如表2所示。由表2可知，在本实验所使用的大米中未检测出Hg2+，该检测方法用于加入大米Hg(NO3)2的检测可获得较为满意的结果。

表 1 不同测定方法实验结果Table 1 Results obtained with different methods

表 2 加入大米中Hg(NO 的检测结果Table 2 Recoveries from rice samples spiked with Hg(NO3)2

3 结 论

本实验利用含有T碱基错配部分互补的两条单链核酸，结合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ，建立了一种大米中Hg2+的定量检测方法。这种分析方法简单快速、选择性好、灵敏度高、检出限低。将这种分析方法应用于大米中Hg2+的检测，获得了满意的结果。

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Dual Color Fluorescence Quantitative Detection of Mercury in Rice

ZHAI Kun1,2, WANG Lianzhi2，XIANG Dongshan1,2,*
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China; 2. School of Chemical and Environmental Engineering, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

A highly sensitive and selective dual color fl uorescence quantitative detection method for mercury (Hg2+) in rice was developed by synchronous scanning fluorescence spectrometry. In this method, two complementary single-stranded nucleic acids with T-T mismatches, SYBR GreenⅠ and graphene oxide were employed. Under the optimum conditions, the total fl uorescence intensity of SYBR GreenⅠ and carboxy-X-rhodamine (ROX) exhibited good linear dependence on the quantity of Hg2+in the range of 5 × 10-10–500 × 10-10mol/L. The fi tted regression equation was ∆IT= 2.121 3 C + 10.536 0 with a detection limit of 2 × 10-10mol/L (3σ). The proposed method displayed a good precision, high selection, simple operation, fast detection, low detection limit and high sensitivity. This method has been applied with satisfactory results.

mercury; quantitative detection; dual color fl uorescence; rice

S132

A

1002-6630（2015）02-0179-05

10.7506/spkx1002-6630-201502034

2014-04-08

国家自然科学基金地区科学基金项目（21465010；31460172）；湖北省教育厅重点项目（D20131905；D20131906）；

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目（PKLHB1316）；湖北省林学一级学科资助项目

翟琨（1978—），女，副教授，硕士，研究方向为土壤化学与环境。E-mail：zk3100@sina.com

*通信作者：向东山（1974—），男，副教授，博士，研究方向为分析化学。E-mail：zk3100@sohu.com