响应面法优化蛇足石杉中石杉碱甲的提取工艺

杨 婷，武 芸*，张 泽，武玉莲，郑小江，胡世坤，毛 鑫

（1.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；3.湖北民族学院附属民大医院，湖北 恩施 445000；4.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064）

响应面法优化蛇足石杉中石杉碱甲的提取工艺

杨 婷1,2,4，武 芸1,2,*，张 泽3，武玉莲3，郑小江1,2，胡世坤2，毛 鑫2

（1.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；3.湖北民族学院附属民大医院，湖北 恩施 445000；4.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064）

利用响应面分析法优化恩施州蛇足石杉中石杉碱甲的提取工艺条件。在以提取温度、提取时间、料液比、酒石酸质量分数为影响因素，以石杉碱甲提取量为指标的单因素试验基础上，根据Box-Behnken原理设计三因素三水平的试验分析法，得到提取石杉碱甲最佳工艺条件：料液比1∶30（g/mL）、酒石酸质量分数1.5%、提取温度41 ℃。采用高效液相色谱法检测石杉碱甲含量，在最优提取条件下，热水浸提4 h，石杉碱甲提取量为11.1928 mg/100 g。

蛇足石杉；石杉碱甲；响应面分析法；高效液相色谱

蛇足石杉（Huperzia serrata）又名千层塔、蛇足石松，为石杉科石杉属多年生蕨类草本植物[1-4]，其有效成分主要是生物碱，生物碱对人类健康有着至关重要的作用，特别是石杉碱甲是目前唯一已知的治疗老年痴呆症的特效药[5-9]。随着社会老龄化的加剧，有可能使罹患老年痴呆症的老年人越来越多，也会使具有特殊治疗功能的石杉碱甲的需求量越来越大，研究与开发蛇足石杉具有很重要的现实意义。蛇足石杉对环境条件要求苛刻，生长缓慢，市场需求量大，在人工合成石杉碱甲的工艺条件还不成熟的情况下，研究提高石杉碱甲的提取率有重要意义[10]。

关于蛇足石杉中石杉碱甲提取工艺的相关文献报道比较多。石杉碱甲含量的测定主要利用比色法和高效液相色谱法，高效液相色谱法具有精确度高、分离效果好等优点，适用于微量物质的测定，目前多利用此法测定石杉碱甲含量。易学文等[11]利用纤维素酶有降解植物细胞壁的特性提取石杉碱甲，但是酶活性易受外界环境影响，价格昂贵，不易实现工业化。近年来多数学者集中在探究不同酸性提取液和酸性提取液pH值对石杉碱甲得率的影响，研究不同洗脱条件下石杉碱甲与其他杂质的分离度[12-13]。何春萍等[14]比较了4 种传统工艺条件对石杉碱甲得率的影响，利用超声法比较了蛇足石杉不同部位中石杉碱甲的含量。研究者在传统工艺条件的基础上，利用超声波、微波辅助提取，提高石杉碱甲的提取率[14-15]。利用数学模型优化试验条件是生物学研究的基础，杨煌记[16]和张馨[17]等利用正交设计优化石杉碱甲提取工艺条件，利用响应面分析法优化石杉碱甲的提取工艺鲜有报道。

本实验在已有研究的基础上，通过响应面分析法优化恩施州蛇足石杉中石杉碱甲的提取工艺，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定石杉碱甲的含量，提高石杉碱甲的提取量，对推动生物医药产业发展和技术进步具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所用材料均采自华中药用植物园。将采集的蛇足石杉整个植株地上部分洗净，自然晾干，于55～60 ℃烘箱中烘至质量恒定，用粉碎机磨成粉末，过60 目筛后装于试剂瓶中，贴上标签，置于干燥器中备用。

甲醇（色谱纯） 德国Sigma公司；石杉碱甲标准品 广州同隽医药科技有限公司；酒石酸、三乙醇胺、磷酸（均为分析纯） 恩施州红霞化工有限公司；双蒸水 实验室自制。

1.2 仪器与设备

RT-02A植物样品粉碎机 弘荃机械企业有限公司；FAI10048电子天平 上海精科天美商贸有限公司；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱 上海迅博实验有限公司医疗设备厂；DIONEX高效液相色谱仪 戴安中国有限公司；Diamonsil HHS型电热恒温水浴锅 上海迅博实验有限公司医疗设备厂；KQ5200E型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q纯水仪/超纯水（电阻率18.2 MΩ/cm2） 美国Millipore公司；J-30I冷冻离心机 美国Beckman公司；进样针、有机滤膜（0.22 μm） 海宁圣华过滤设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石杉碱甲提取工艺流程

精确称取蛇足石杉粉末1.000 g→溶于1.5%酒石酸溶液超声波辅助提取30 min→一定温度条件下热水浸提一段时间（变量）→冷冻离心15 min（10 000 r/min）→取上清液→用氯仿（10 mL）萃取→浓缩→酒石酸定容至25 mL→HPLC测石杉碱甲含量。

1.3.2 HPLC条件[17-19]

色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为体积分数0.02%甲醇-三乙胺（甲醇与三乙胺体积比9∶1，pH 7.5），流速0.8 mL/min，检测波长311 nm，柱温25℃，进样量20 μL。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 酒石酸质量分数对石杉碱甲提取量影响

精密称取1.000 g蛇足石杉粉末15份（各3次重复）于锥形瓶中，分别加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的酒石酸15 mL，超声30 min后，于50 ℃热水中提取1 h，10 000 r/min离心15min，收集上清液，氯仿萃取，浓缩，定容到25 mL，0.22 μm滤膜过滤，进样20 μL，于311 nm波长处测石杉碱甲峰面积，比较酒石酸质量分数对石杉碱甲提取量的影响。

1.3.3.2 提取时间对石杉碱甲提取量的影响

分别精密称取1.000 g蛇足石杉粉末15 份（3 次重复）于锥形瓶中，加入2.0%酒石酸溶液15 mL，提取温度为50 ℃，研究提取时间对石杉碱甲提取量的影响。

1.3.3.3 料液比对石杉碱甲提取量的影响

提取时间为4h，温度为50℃，酒石酸质量分数为2.0%的条件下，料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），研究料液比对石杉碱甲提取量的影响。

1.3.3.4 提取温度对石杉碱甲提取量的影响

研究提取温度变量对石杉碱甲提取量的影响，提取时间4 h、料液比1∶35、酒石酸质量分数2.0%的条件下，提取温度分别为30、40、50、60、70、80 ℃。

1.3.4 Box-Behnken试验设计

根据Box-Behnken试验设计原理及单因素试验的结果，选取对试验结果有显著影响的因素，设计三因素三水平的响应面试验方案（表1）。

表 1 Box-Behnken试验设计因素水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 石杉碱甲的稳定性分析

2.1.1 石杉碱甲的HPLC图

通过对色谱柱及流动相研究，选择合适实验条件，利用1.3.2节色谱条件扫描标准品和样品中石杉碱甲的色谱图见图1，石杉碱甲的保留时间较长，分离度较高，表明石杉碱甲与其他成分能够很好地分离，此条件有利于石杉碱甲含量的测定。

图 1 石杉碱甲标准品及样品高效液相色谱图Fig.1 HPLC of huperzine A standard and huperzine A extracted from Huperzia serrata

2.1.2 稳定性实验

取0.01 mg/mL石杉碱甲对照品溶液，分别放置2、4、6、8、10 h后进样，测定日内精密度，石杉碱甲峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.169%、1.170%、1.172%、1.173%、1.171%；连续3 d重复实验，测定日间精密度，RSD分别为1.161%、1.184%、1.201%，结果表明稳定性良好。

2.1.3 精密度实验

取0.01 mg/mL石杉碱甲对照品溶液，重复进样5 次，测石杉碱甲峰面积的RSD为1.664%（n=5）。

2.2 线性关系考察

精密称取石杉碱甲标准品0.500 mg，溶解在1.5%酒石酸溶液中，定容到50 mL，配制成0.01 mg/mL石杉碱甲标准品溶液。分别吸取石杉碱甲标准品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中配成不同质量浓度的对照品溶液，过0.45 μm滤膜，进样20 μL，于311 nm波长处分别测定峰面积。以峰面积为横坐标，对照品质量浓度为纵坐标，对其进行线性回归，绘制标准曲线。得回归方程：y=0.001x+0.000 2，R2=0.999 6，结果表明石杉碱甲在0.5～5 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 酒石酸质量分数对石杉碱甲提取量的影响

图 2 酒石酸质量分数对石杉碱甲提取量的影响Fig.2 Effect of tartaric acid concentration on the yield of huperzine A

表 2 不同酒石酸质量分数条件下石杉碱甲提取量Duncan多重比较（n= 3）Table 2 Duncan s comparison for the yield of huperzine A with different concentrations of tartarid acid (n= 3)

图2表明，当酒石酸质量分数为2.0%时，石杉碱甲提取量最高，可能是因为酒石酸质量分数为2.0%时溶解度达到饱和，当酒石酸质量分数继续升高时，石杉碱甲的提取量不但没有提高反而下降了。为了弄清所选取水平的区分度，通过SPSS 18.0软件分析得到多重比较结果（表2），酒石酸质量分数的5 个水平均没有在同一列，表明酒石酸质量分数的这5 个水平之间均具有显著性差异。

2.3.2 提取时间对石杉碱甲提取量的影响

图 3 提取时间对石杉碱甲提取量的影响Fig.3 Effect of extraction duration on the yield of huperzine A

如图3所示，提取时间对石杉碱甲提取量影响不大，当时间为4 h时石杉碱甲提取量最高。可能是因为在4 h前，植物细胞壁没有被全部穿透，石杉碱甲没有完全被释放出来，但是当提取时间过长时，石杉碱甲经过长时间受热，溶解成分被破环或者其他浸出物与石杉碱甲发生了反应。由表3可知，时间长短对试验结果的多重比较分析中，提取时间1 h和提取时间5 h（在同一列）石杉碱甲提取量差异不明显，与其他水平之间有显著性差异。因此，在响应面试验中，提取时间选取4 h。

表 3 不同提取时间条件下石杉碱甲提取量Duncan多重比较（n = 3）Table 3 Duncan s comparison for the yield of huperzine A different extraction durations (n= 3)

2.3.3 料液比对石杉碱甲提取量的影响

图 4 料液比对石杉碱甲提取量的影响Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of huperzine A

表 4 不同料液比条件下石杉碱甲提取量Duncan比较（n = 3）Table 4 Duncan s comparison for the yield of huperzine A with different material-to-liquid ratios (n = 3)

如图4所示，当料液比为1∶35时，石杉碱甲提取量最高（9.2 mg/100 g）。多重比较分析结果见表4，各因素都不在同一列，它们之间都具有显著性差异。

2.3.4 提取温度对石杉碱甲提取量的影响

如图5所示，当温度为40 ℃时，生物碱石杉碱甲的化学结构较少被破坏，溶解速率较快，使得石杉碱甲提取率最好。当温度高于40 ℃时，生物碱的化学结构遭到较为严重的破坏，化学结构被破坏的速率比增加的溶解速率要快，两者的综合作用，导致石杉碱甲提取量反而下降了，显著性分析结果见表5，温度对石杉碱甲的浸提具有显著性影响。

图 5 提取温度对石杉碱甲提取量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of huperzine A

表 5 不同提取温度条件下石杉碱甲提取量Duncan比较（n = 3）Table 5 Duncan s comparison for the yield of huperzine A with different extraction temperatures (n = 3)

2.4 响应面试验结果

表 6 响应面试验设计与结果Table 6 Response surface experimental design and results

以单因素试验结果为基础，选择对石杉碱甲提取量有显著影响的提取因素（酒石酸质量分数、料液比、提取温度），响应面设计及结果见表6。对试验结果进行多元回归拟合，通过多重分析，考察不同因素水平对试验结果的影响，同时得到二次回归方程为：Y=9.67—0.73A+ 0.17B+0.19C+0.23AB—0.15AC+0.14BC+0.63A2+0.37B2—0.94C2。由表7可知，对石杉碱甲提取量有显著影响的是酒石酸质量分数的一次方及二次方，提取温度的二次方对试验结果影响极显著。

表 7 回归方差分析结果Table 7 Analysis of variance of the regression equation

2.5 响应面法优化石杉碱甲提取量的工艺条件

根据回归方程在考察范围内绘制酒石酸质量分数、料液比、提取温度这3 个因素的等高线及三维效果图（图6～8）。各图均是以一个因素为零点，研究其他两个因素对石杉碱甲提取量的影响。

图 6 酒石酸质量分数和料液比对石杉碱甲提取量的影响Fig.6 Effects of tartaric acid concentration and material-to-liquid ratio on the yield of huperzine A

图 7 提取温度和料液比对石杉碱甲提取量的影响Fig.7 Effects of extraction temperature and material-to-liquid ratio on the yield of huperzine A

图 8 提取温度和酒石酸质量分数对石杉碱甲提取量的影响Fig.8 Effects of extraction temperature and tartaric acid concentration on the yield of huperzine A

为了得到提取石杉碱甲的最佳工艺条件，通过对以上数据的分析，得知酒石酸质量分数1.5%、料液比1∶30、提取温度41 ℃时，石杉碱甲提取量为11.38 mg/100 g。

2.6 验证实验

为验证响应面分析法所得模型的准确性，取酒石酸质量分数1.5%、料液比1∶30、提取温度41 ℃、提取时间4 h，对模型进行4 次平行验证实验，得到平均提取量为11.192 8 mg/100 g，结果见表8。通过分析表8的数据，可见该模型能较好地模拟和预测千层塔中石杉碱甲提取量，为优化石杉碱甲提取工艺条件提供了可靠的理论依据。

表 8 验证实验结果Table 8 Validation of optimized extraction conditions

3 结 论

根据Box-Behnken试验设计原理和响应面分析方法，利用Design-Expert 7.0软件进行试验设计和统计分析，得到了石杉碱甲提取量与料液比、酒石酸质量分数和提取温度的回归模型，对方程进行求解得到提取石杉碱甲的最佳工艺条件为料液比1∶30、酒石酸质量分数1.5%、提取温度41 ℃，石杉碱甲提取量为11.1928 mg/100 g。通过验证性实验，证明此条件下石杉碱甲提取量的可靠性，恩施州蛇足石杉石杉碱甲含量高于相关的报道[20-22]，可能是蛇足石杉产地及品种不同的缘故。为了验证这一推测，在此最佳条件下检测了贵州产的蛇足石杉中石杉碱甲的含量，其提取量仅为2.15 mg/100 g，说明石杉碱甲含量的高低可能与产地和品种有关，也可能与产石杉碱甲的内生真菌的种类和数量有关[23-26]。

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Optimization of Extraction Process for Huperzine A from Huperzia serrata

YANG Ting1,2,4, WU Yun1,2,*, ZHANG Ze3, WU Yulian3, ZHENG Xiaojiang1,2, HU Shikun2, MAO Xin2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. College of Biological Scientifi c and Technical, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 3. University Hospital of Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 4. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

This paper is concerned with the selection and optimization of important extraction parameters as well as their levels for the increased yield of huperzine A from the aboveground parts of Huperzia serrata by combined use of single factor method and response surface methodology (RSM). Solid-to-solvent ratio, solvent concentration and temperature were identifi ed as main variables that affect extraction effi ciency, and their levels were optimized using RSM based on a threevariable, three-level Box-Behnken design. When the extraction was performed for 4 h under the optimized conditions: 1.5% tartaric acid as extraction solvent with a solid-to-solvent ratio of 1:30 (g/mL) and an extraction temperature of 41 ℃, the yield of huperzine A was 11.192 8 mg/100 g.

Huperzia serrata; huperzine A; response surface analysis; high performance liquid chromatography

TS201

A

1002-6630（2015）02-0057-06

10.7506/spkx1002-6630-201502011

2014-06-30

湖北省教育厅科学技术研究项目（D20141903）；湖北省自然科学基金项目（2014CFB615）；生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目（PKLHB1301）；恩施州2013科技研究与开发项目（2013002）；国家级大学生创新课题项目（201210517030）；湖北民族学院大学生创新训练计划项目（2014Z064）；

湖北民族学院林学一级学科（0907）资助项目

杨婷（1991—），女，学士，主要从事天然产物的提取与分离研究。E-mail：1287439660@qq.com

*通信作者：武芸（1971—），女，副教授，硕士，主要从事植物生物技术及生物资源保护与利用研究。E-mail：wuyun2058@sohu.com