防治稻水象甲优效球孢白僵菌YS03菌株产孢培养基优化

狄雪塬，杨茂发，3*，邹 晓

(1.贵州大学昆虫研究所，贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550025;2.贵州大学真菌资源研究所，贵阳 550025;3.贵州大学烟草学院，贵阳 550025)

稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel 原产北美，19 世纪随着密西西比河流域水稻大规模种植而转入稻田危害，并逐渐成为水稻的毁灭性害虫(Zou et al.，2004)，1988年传至中国，是我国重要的检疫害虫，其成虫取食水稻的细嫩部分，影响水稻的光合作用，幼虫危害根部，阻碍养分传输，使水稻苗生长速度减缓，植株矮化，分蘖能力下降，最终导致水稻产量下降，一般造成减产10%-30%，严重时达50% 以上，甚至绝收(Zou et al.，2004)。

目前对稻水象甲的防治主要以化学防治为主(蔡明等，2000)，化学药剂可以在短时间内控制虫口的数量，但农药的大量使用导致稻水象甲抗药性问题日趋严重，并带来了防治成本的增加和生态系统恶化等一系列问题(Saito et al.，2005)。生物防治是基于生态平衡的原理，利用天敌的作用来调节有害生物种群密度，使之长期稳定在不危害的水平(蔡明等，2003)，但原产于北美洲的天敌并没有随之传入，因此稻水象甲的天敌匮乏，生物防治研究进展甚微(于风泉等，2003)。

20 世纪80年代，日本学者致力于寻找其天敌，研究得出只有绿僵菌和白僵菌对成虫具有较强的致病性，可被作为微生物防治的材料(Nagano，1987;Yozhlzawa，1993)。球孢白僵菌是一种致病性强、寄主范围广、适应性广的昆虫病原真菌，可侵染15 目149 科的700 余昆虫，因其还具有不污染环境、无公害、易培养等优点，在生物防治中日益受到关注(冈田齐夫和马桂椿，1984)。20 世纪80年代以来，国内学者开展了较多的利用球孢白僵菌防治稻水象甲的试验研究(李增智，1996;蒋明星等，2002;于凤泉等，2003;徐进等，2013;关志坚等，2014)，筛选了一些致病力强的菌株，并在田间应用上表现出良好的防效。球孢白僵菌YS03 菌株系本项目组徐进(2013)等筛选出的对稻水象甲成虫致病力强的优效菌株，该菌株在孢子浓度为2.0×108个/mL 接种处理后，26℃条件下第15 天供试成虫平均校正死亡率达96.55%。为了让YS03 菌株有效的应用于稻水象甲的防控实践中，我们对其培养基的配方进行了初步探索，旨在研究出原料廉价易得、制备方法简便、营养能完全满足菌种生长且方便批量生产的培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:YS03 白僵菌菌种，由贵州大学生命科学学院真菌资源研究所提供。

原料:麦麸、米糠、玉米粉、花生、面粉、燕麦、豌豆粉、百合粉等。

药品:蛋白胨、葡萄糖、琼脂等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养

由贵州大学生命科学学院真菌资源研究所提供的YS03 白僵菌菌株，先将保藏的菌种接种在PDA 斜面培养基上于25℃及12L∶12D 条件下活化培养7 d 待用。

1.2.2 培养基的制备

市场上购买原材料，以PDA 培养基中提供的营养成分含量(主要依据碳源和氮源)为参照，根据各材料所含营养成分的不同，每种材料设计3个梯度，各梯度原材料加水1000 mL，煮沸20-30 min，用纱布过滤，加水至1000 mL，再加入30 g 琼脂，加热让其充分溶解即可。

1.2.3 培养基单因素筛选实验

将制备好的培养基灭菌然后倒平板，编号，待其冷却凝固，将之前培养好的YS03 白僵菌用直径1 cm 的打孔器打孔，接在培养皿上，每皿接3孔，25℃培养，48 h 后第一次观察并记录菌落直径及生长状态，之后每24 h 观察一次，观察7 d，然后用血球计数法测量各培养基的孢子量。

1.2.4 培养基的响应面优化

根据单因素结果利用Box-Behnken 进行试验设计，共有17 组试验，把每组试验的不同配方按比例称好，培养基的制备同1.2.2，观察方法同1.2.3。将得出的结果输入Design-Expert 8.0 中进行响应面分析，从而优化培养基的组分，获得最佳配方。

1.2.5 验证实验

经过Design-Expert 8.0 的响应面分析得出一个最佳配方，重复以上培养基的制备和试验方法，以PDA 培养基为对照培养基，验证试验结果。

2 结果与分析

2.1 培养基的单因素实验

8种单因素实验结果采用SPSS 17.0 对数据进行对数转换，方差分析，得到各因素之间差异显著，多重比较选出对YS03 球孢白僵菌产孢量影响比较大的三种原料:花生50 g，麦麸150 g，玉米粉200 g，从而筛选出花生、麦麸、玉米粉三种配料作为制备培养基的基础原料。

2.2 培养基的响应面优化

2.2.1 Box-Behnken 实验设计

根据Box-Behnken 的中心组合实验设计原理，综合单因素试验结果，选取花生、麦麸、玉米粉对YS03 球孢白僵菌产孢量影响较大的三个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，实验的各因素水平见表2，实验设计及结果如表3，其中12 组为析因试验，5 组为重复的中心点试验，用于考察模型的误差。

表1 不同浓度产孢量的方差分析Table 1 Analysis of variance (ANOVA)for different concentration of spore yields

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels of RAS test

表3 实验设计及结果Table 3 Experimental design and results

(续上表)

2.2.2 二次回归模型的建立及显著性检验

利用统计软件对实验数据进行回归拟合，得出多元线性模型回归结果:Y=-3.96258×108+5.54067×106X1+1.731×106X2+5.273×105X3+2.04×104X1X2-2.49×104X1X3+1.92×104X2X3-4.104×104X12-3.05×104X22-2.97×104X32，其中X1、X2、X3分别是花生、麦麸和玉米粉，Y值为产孢量。对该二项式回归模型进行方差分析，见表3。该模型方程具有显著差异。失拟差不显著，表明方程的拟合不足实验不显著，没有明显失拟因素存在，对模型是有利的。因此，该模型可以用于对YS03 球孢白僵菌的产孢量进行分析和预测。

表4 产孢量回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA)for regression equation

2.2.3 响应曲面分析与优化条件的确定

为了进一步探索X1、X2、X3的交互作用对响应值Y 的影响，采用Design-Expert 软件绘制了等高线图及对应的三围响应曲面图。图1-3 为分别固定三个影响因素之一，考察其他两个因素对响应值影响的曲面图，图底部平面为等高线，等高线图的重合区域用来进行各影响因素的优化。等高线的形状和线间的疏密程度均能反应出两变量间交互作用的大小，椭圆形、线间密度大的表示交互作用大，圆形、线间密度小的表示交互作用小;响应面曲面倾斜度大表示交互作用大，响应面曲面倾斜度小表示交互作用小 (雷欣宇等，2013)。由图1-3 分析可得，两两因素之间对响应值Y 均有一定的交互作用，其中花生和玉米粉的交互作用最为显著。

图1 为X2(麦麸)在0 水平时，X1(花生)与X3(玉米粉)交互作用的等高线图及相应响应面图。由图可知，当X1值一定时，随着X3值在一定范围内增加，响应值Y 也随之增加，在X3取值在85-105 范围内，Y 达到最大值，但当X1继续增加时，Y 值则会下降。说明玉米粉的含量在一定范围内会增加白僵菌的产孢量，但超过这个范围，便会抑制产孢量。当X3值一定时，随着X1值得增加，Y 值也是先上升后下降，X1取值范围为45-105 时，产孢量最大，X1值过高过低都不利于白僵菌的产孢量。

同理，由图2、图3 分析可得，当X1值一定时，产孢量达到最大值时，X2的取值范围为78-80，当X2值一定时，产孢量达到最大值时，X1的取值范围为55-65;当X2值一定时，X3取值范围在85-105 时，产孢量可达到最大响应值区域，当X3值一定时，X2取值范围在70-80 时，产孢量可达到最大响应值区域。

根据Box-Behhnken 实验设计结果，优化的最终结果为:花生59.59 g，麦麸76.08 g，玉米粉88.33 g，这个最佳配方产孢量的预测值为6.76×107个/mL。

图1 花生与玉米粉交互作用响应面图及等高线图Fig.1 Response surface and contour plot showing the interactive effects of peanut and maizena on the spore yields

图2 花生与麦麸交互作用响应面图及等高线图Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of peanut and bran on the spore yields

图3 麦麸与玉米粉交互作用响应面图等高线图Fig.3 Response surface and contour plot showing the interactive effects of bran and maizena on the spore yields

2.3 验证实验

为了验证模型预测的准确性及优化培养基产孢量的效果，对优化后的培养基和对照培养基(PDA)分别进行产孢量测定试验，优化培养基的产孢量为6.15×107个/mL，其实际试验值与模型预测值6.76×107个/mL 基本一致，说明此配方是可靠的。对照培养基的产孢量为3.2×107个/mL，优化培养基产孢量是对照组产孢量的1.92 倍。

3 结论与讨论

球孢白僵菌是一种重要昆虫病原真菌，已经用于多种农林害虫的微生物防治 (罗成等，2011)，徐进等(2013)筛选出了对稻水象甲的致病力强的优效球孢白僵菌YS03 菌株，本试验通过单因素试验、响应面试验得出使YS03 球孢白僵菌产孢量最大的培养基配方为花生∶麦麸∶玉米粉=2.6∶3.5∶3.9。

前人对培养基的筛选做了很多工作，筛选出葡萄糖2%、牛肉蛋白胨1%、牛肉浸膏0.3% 和K2HPO41%为嗜线虫致病杆菌HB310 培养基的最佳配方 (王永娟等，2014);葡萄糖3.2%、CaCO30.84%和番茄33%为嗜酸乳杆菌培养基的最佳配方(雷欣宇等，2013)，这些均是对细菌培养基的优化，而对球孢白僵菌培养基的筛选及优化，徐文静等 (2006)实验表明球孢白僵菌在L-broth 培养基上生长最快;王韬远等 (2013)研究得出，在PPDA 培养基中添加70 mg/L 的多果定，125 mg/L 头孢霉素和138 mg/L 硫酸卡那霉素为球孢白僵菌最适培养基。这些培养基的优化都是基于已有培养基进行优化的，而本实验则是利用简单易得的农副产品筛选出适合球孢白僵菌YS03 菌株生长的培养基配方，且其产孢量并不低于已有培养基。

王滨等(2000)做球孢白僵菌选择性培养基的筛选时，筛选出燕麦培养基对球孢白僵菌生长有利而对其它杂菌有明显的抑制作用。本实验也发现，燕麦培养基菌落生长和产孢量都不理想，几乎没有杂菌出现，这一现象与王滨的实验结果一致。徐文静等(2006)以菌落直径为观测值得出PDA 培养基要优于花生培养基，本实验以产孢量为观测值，花生培养基要优于PDA 培养基，本实验的花生培养基与徐文静实验中的花生培养基成分不同，且观测的生物学特性不同，可能还存在别的原因，有待进一步探讨。

从响应面分析图中可看出，每种配料都是在一定范围内产孢量会达到最高值，随着配料的继续增加，产孢量反而会减少，说明白僵菌对不同营养的需求是有一定比例的，过高过低都不能使菌株很好的生长，只有配料比例适当才能更好更快的培养白僵菌。

邝灼彬等(2005)在最适温度下，得到的球孢白僵菌的最高产孢量达6.40×107个/mL，齐永霞等(2011)实验中球孢白僵菌最高产孢量为5.42×107个/mL。本试验优化后的最佳配方使白僵菌的产孢量达到6.15×107个/mL，与其他研究者产孢量的差异可能由于培养条件和菌株差异引起的，试验中对照培养基的产孢量仅为3.2×107个/mL，优化培养基产孢量是对照组(PDA)产孢量的1.92 倍，且优化后的培养基要优于任何单一培养基的产孢量，表明优化后的培养基能增加产孢量，其配方能较好的满足规模化培养白僵菌的需要，且配方材料简单易得，该研究具有较好的应用前景。

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