大黄素对3T3-L1脂肪细胞PTEN的抑制作用

田 雪，赖文芳，向 青，洪桂祝

（福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122）

胰岛素抵抗是2型糖尿病一个主要特征，在最初阶段胰岛素和自由基分泌不足引起葡萄糖和脂肪酸调节异常［1］。第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白（PTEN）是一种脂质磷酸酶，PTEN表达上调或活性增强是导致胰岛素抵抗的一个主要发生机制，有望作为改善胰岛素抵抗的一个新靶点［2-3］。大黄素化学名1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根及掌叶大黄根茎的成分之一，具有抗菌消炎、抗肿瘤、调节免疫等作用［4-6］。 其抗炎作用可用来防治糖尿病［7］。 本实验通过质粒过表达PTEN基因来研究大黄素对PTEN的抑制作用。

1 材 料

1.1 药品与试剂 大黄素标准品 （上海皇晶生物科技有限公司，批号：20111120006，纯度≥98%）；小鼠3T3-L1成纤维细胞 （中国科学院上海生命科学研究院）；RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美国 Fermentas公司）；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 （上海碧云天生物技术研究所）；Qiagen Plasmid Mini Kit（德国 Qiagen 公司，批号：12123）；RNeasy®Mini Kit（德国 Qiagen 公司，批号：74104）；小鼠白介素-6 ELISA试剂盒 （武汉博士德生物技术有限公司，批号：EK0555）；PTEN质粒（美国 Addgene 公司，批号：1502）；pCMV Flag WT-PTEN（美国 Addgene 公司，批号：22231）；EntransterTM-D（北京 Engreen 公司，批号：4000-1）；PTEN 抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc-7974）；β-actin（上海碧云天生物技术研究所，批号：AA128）；地塞米松（美国Sigma-Aldrich公司，批号：D1756）；胰岛素 （美国Sigma-Aldrich 公司，批号：10305000）；异丁基甲基黄嘌呤（美国 Sigma-Aldrich公司，批号：I7018）。

1.2 实验仪器及设备 Heracell 150i CO2培养箱（美国 Thermo Fisher公司）；Mini PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽；Mini Trans-Blot小型转印槽；ChemiDoc XRS＋凝胶成像系统；C1000PCR仪 （美国Bio-rad公司）；7900HT荧光定量PCR仪 （美国Applied Biosystems公司）。

2 方 法

2.13T3-L1前脂肪细胞培养 3T3-L1前脂肪细胞用10%小牛血清的高糖DMEM细胞培养液培养，细胞培养于37℃、5%CO2培养箱中。

2.23T3-L1前脂肪细胞的诱导分化 细胞长满至培养瓶的80%～90%时接种到24孔板中，48 h后开始分化。用第1诱导液（10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM，0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤，1.0 μg／mL胰岛素和1.0 μM地塞米松）培养细胞48 h，更换为第2诱导液 （10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM，1 μg／mL 胰岛素）继续培养，37℃、5%CO2条件下培养16 d，2～3 d更换1次培养液。电子显微镜下观察细胞内有油滴聚集，即表示诱导分化成功。 细胞经 10 ng／mL LPS刺激后， 加入 1、10、50 μM浓度的大黄素作用24 h，收集细胞及其上清液。

2.3 PTEN质粒培养与提取 将菌落接种到含100 mg／mL青霉素的大肠杆菌液体培养液中，37℃摇床培养过夜。按照Qiagen Plasmid Mini Kit试剂盒步骤提取，加100 μL TE缓冲液溶解，-20℃保存。质粒 DNA的 A260／A280在 1.80～2.20，纯度良好，符合实验要求。

2.4 PTEN质粒转染 将2 μg PTEN DNA加入含1%胎牛血清的25 μL DMEM混匀，制成DNA稀释液；将4 μL的EntransterTM-D加入含1%胎牛血清的25 μL DMEM混匀，制成EntransterTM-D稀释液；将2种稀释液充分混匀，室温静置30 min后，用1%胎牛血清的DMEM稀释，使质粒浓度为2 μg／mL；加入到 24 孔板中，每孔 1 mL，2 h 后加入10 ng／mL LPS、10 μM 的大黄素作用 24 h；阴性对照组只加入稀释后的EntransterTM-D，收集细胞及细胞上清液。

2.5 检测细胞上清液IL-6含量 利用ELISA法测定IL-6的含量，操作步骤按照说明书进行。

2.6 Western blot检测 提取细胞蛋白，用10%SDS-PAGE凝胶电泳，90Ⅴ，45 min转移至硝酸纤维素膜，室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜（PTEN一抗 1∶1000，β-actin 1∶8000），二抗用抗鼠抗体（1∶5000）室温摇床孵育2 h，加入ECL化学发光试剂于凝胶成像系统显像，Quantity One软件检测信号条带灰度值。

2.7 RT-PCR检测基因的表达 用QIAGEN RNeasy®Mini Kit提取细胞总 RNA，测得 A260／A280 为 1.8～2.0，RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行逆转录。PCR反应以逆转录产物为模板，扩增条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40个循环。 重复检测3次，每次做2个复孔，计算2个复孔的Ct值，分别以同一个样品的18S为内参计算2-ΔΔCt值。引物序列见表1。

表1 PTEN、IL-6、18S基因引物序列信息

2.8 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，所得数据用（±s）表示。组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

见表2～表4。

表2 大黄素对PTEN mRNA表达水平和蛋白含量的影响（±s）

表2 大黄素对PTEN mRNA表达水平和蛋白含量的影响（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与 1 μM 大黄素组比较，3） P＜0.05。

PTEN 蛋白 ／β-actin 0.990±0.0640.457±0.122）0.216±0.0562）0.162±0.0412）3）组 别空白组1 μM 大黄素组10 μM 大黄素组50 μM 大黄素组n3333 PTEN mRNA／18S 1.000±0.0000.549±0.1561）0.574±0.0952）0.481±0.0722）

表3 PTEN质粒转染后大黄素对PTEN mRNA表达水平和蛋白含量的影响（±s）

表3 PTEN质粒转染后大黄素对PTEN mRNA表达水平和蛋白含量的影响（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05；与质粒组比较，3） P＜0.01；与 10 μM 大黄素组比较，4） P＜0.05。

PTEN 蛋白 ／β-actin 1.000±0.0410.980±0.0752.507±0.1051）0.674±0.0522）1.235±0.0713）组 别空白组阴性对照组质粒组10 μM 大黄素组质粒＋大黄素组n44444 PTEN mRNA／18S 1.000±0.0000.969±0.1564.047±0.4721）0.578±0.0662）1.479±0.2573）4）

表4 PTEN质粒作用后IL-6 mRNA和上清液中IL-6的变化（±s）

表4 PTEN质粒作用后IL-6 mRNA和上清液中IL-6的变化（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05，2）P＜0.01；与质粒组比较，3） P＜0.05。

IL-6 含量 ／（pg／mL）1.000±0.0000.985±0.0911.878±0.0922）0.716±0.0571）1.399±0.1463）组 别空白组阴性对照组质粒组10 μM 大黄素组质粒＋大黄素组n66666 IL-6 mRNA／18S 1.031±0.2500.479±0.0831.342±0.4191）0.336±0.0231）0.264±0.1103）

4 讨 论

磷脂酰肌醇3激酶 （PI3K）／Akt通路是胰岛素主要信号传导通路，PTEN是PI3K／Akt通路公认的负性调节因子，抑制PTEN可增加胰岛素的敏感性，并改善胰岛素抵抗［8］，炎症在胰岛素抵抗的发展中起到重要作用［9］。结果表明：大黄素能抑制PTEN的基因和蛋白的表达。3T3-L1脂肪细胞经PTEN质粒转染后，使PTEN基因和IL-6过表达，大黄素作用于经质粒转染的脂肪细胞后，能明显降低IL-6的含量，明显降低PTEN基因和蛋白的表达。大黄素可通过抑制PTEN降低脂肪组织中炎症因子的释放，改善胰岛素抵抗。

［1］ANAND S，MUTHUSAMY VS，SUJATHA S，et al.Aloe emodin glycosides stimulates glucose transport and glycogen storage through PI3K dependent mechanism in L6 myotubes and inhibits adipocyte differentiation in 3T3L1 adipocytes［J］.Febs Lett，2010，584（14）：3170-3178.

［2］PLANCHON S M.Abrogating the induction of Type 2 Diabetes mellitus secondary to statin therapy［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2014，28（5）：393-394.

［3］BIMBAUM Y，NANHWAN M K，LING S，et al.PTEN upregulation may explain the development of insulin resistance and Type 2 Diabetes with high dose statins［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2014，28（5）：447-457.

［4］沈爱娟，蔡宛如.大黄素抗炎作用及对急性肺损伤治疗作用研究进展［J］.浙江中医药大学学报，2013，37（10）：1261-1264.

［5］孙桂斌，张萌，严方，等.大黄素抗肿瘤活性及相关机制研究进展［J］.药学进展，2013，37（6）：248-256.

［6］黄伟锋.大黄素的药理作用研究进展［J］.柳州医学，2013，26（4）：241-244.

［7］宋冰，刘学政.大黄素对2型糖尿病小鼠血糖、胰岛素水平的影响及机制探讨［J］.山东医药，2011，51（38）：32-33.

［8］曹洪义，杨秋，童南伟.PTEN与胰岛素抵抗和2型糖尿病［J］.国际内分泌代谢杂志，2013，33（5）：335-338.

［9］JUNG C，TSAI Y，CHANG C，et al.Allergen exposure induces adipose tissue inflammation and insulin resistance［J］.Int Immunopharmacol，2014，23（1）：104-112.