冬虫夏草多糖肽的提取与制备

陈肖虹，黄宏南

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2.福建省疾病预防控制中心，福建 福州 350001）

多糖肽是一种糖蛋白，是多糖与蛋白质的结合体。真菌多糖肽一般都具有抗肿瘤活性和提高免疫力的生物活性。国内期刊数据库检索发现，关于冬虫夏草中虫草素、虫草酸、腺苷等成分的研究已十分普遍，然而关于虫草多糖的研究报道主要集中在近十年且较少，而对虫草多糖肽的研究则难觅踪迹。因此，包含多糖肽在内的多糖类成分将是虫草开发研究的一个重要突破口。本研究提出一种制备冬虫夏草多糖肽（纯度＞95%）的方法，可用于该类产品的测定，此项研究尚未见文献记载。

1 研究背景

多糖肽引起医药界广泛兴趣源于1977年，日本吴羽化学（Kureha Chemicals）利用热水萃取法和硫酸胺盐析法纯化出CM101品系云芝菌丝体的云芝糖肽［1］。1989 年杨 庆尧等［2-3］改用热 水 浸取和 醇析法萃取出 Cov-1品系云芝菌丝体中的云芝糖肽（polysaccharide peptides，PSP）。近年来学者对真菌多糖肽的研究偏少，主要是从云芝、灵芝属等中提取多糖肽。在提取与制备方法上，传统的云芝糖肽多以干燥的菌丝体为材料，用盐析法、水提醇沉法等提取制备，但这些方法所得产品都是粗制品，含有大量鞣质、蛋白质、脂肪等，须用层析法等进行条件优化得到纯品。灵芝属多糖肽，既有用子实体也有用菌丝为材料，同样多采用热水浸提和乙醇沉淀的方法制备［4-6］。 2007 年 Jung-Young 等［7-8］从蜂头虫草（Cordyceps sphecocephala）J-201菌丝深层发酵液中通过乙醇沉淀法提取出PSP。因此，本文采用乙醇沉淀法制备冬虫夏草多糖肽，但由于不同真菌产生的多糖肽在量化性质上稍有差别，所以在具体提取工艺流程和条件上较之前研究有区别。

2 制备方案

在制备冬虫夏草多糖肽之前，首先需要获得含有高分子量的多糖肽溶液，本课题以冬虫夏草纯粉为原料的水提取液，将其浓缩、离心、透析、截留而获得的含有高分子量的冬虫夏草多糖肽。冬虫夏草多糖肽溶液的工艺流程见图1，得到冬虫夏草多糖肽纯品。本节给出的是通用的实施方式，其本质是乙醇沉淀法。

2.1 粗品制备 用浓度为1%的冬虫夏草多糖肽溶液，在不断搅拌中缓慢滴加无水乙醇至原体积的一半，即 1∶0.5（V／V），置冰箱过夜，离心（10000～12000 r／min），用无水乙醇分级沉淀，收集 33%乙醇沉淀部分，置冰箱，真空干燥得第1级成分为冬虫夏草多糖肽I。取上清液再滴加无水乙醇至1∶1（V／V），置冰箱过夜，离心（10000～12000 r／min），用无水乙醇分级沉淀，收集33%～50%的沉淀，置冰箱真空干燥得第2级成分为冬虫夏草多糖肽Ⅱ。将上清液继续加乙醇至 1∶1.5（V／V），得第 3级成分冬虫夏草多糖肽Ⅲ，置真空低温干燥得冬虫夏草多糖肽粗品。

2.2 纯品制备 取冬虫夏草多糖肽Ⅲ （冬虫夏草多糖肽粗品）以1∶10比例加水微热溶解，离心去杂，通过聚丙烯胺凝胶Bio-Gel系列多次柱分离，用含50 mol／L NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH＝5.8～6.0，0.2 mol／L），透析 12～20 h，取袋内液浓缩，用3倍无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，得浅褐色粉末状物质为冬虫夏草多糖肽。

3 制备和HPLC法测定

3.1 制备实例 为验证本文提出的制备工艺，本文借助福建省疾病预防控制中心理化实验室实施了多次实验，本节给出一个实施案例如下。

3.1.1 实施步骤1 用浓度为1%的冬虫夏草多糖肽溶液，在不断搅拌中缓慢滴加无水乙醇至1∶0.5（V／V），置冰箱过夜，用 11000 r／min 离心，用无水乙醇分级沉淀，收集33%乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得冬虫夏草多糖肽I。

3.1.2 实施步骤2 取“3.1.1”项中沉淀后上清液滴加无水乙醇至1∶1（V／V），同上处理后收集33%～50%的沉淀，置冰箱真空干燥得冬虫夏草多糖肽Ⅱ。

3.1.3 实施步骤3 将“3.1.2”项沉淀后上清液再加乙醇至 1∶1.5（V／V），得冬虫夏草多糖肽Ⅲ，置真空低温干燥即得冬虫夏草多糖肽粗品。

3.1.4 实施步骤4 取“3.1.3”项所得冬虫夏草多糖肽粗品以1∶10比例加水微热溶解，用11000 r／min离心去杂，通过聚丙烯胺凝胶Bio-Gel系列多次柱分离，用含50 mol／L NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH＝5.9，0.2 mol／L），透析 16 h，取袋内液浓缩，用3倍无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，得浅褐色粉末状物质为冬虫夏草多糖肽纯品。

3.2 HPLC法测定

3.2.1 测定方法及条件 采用HPLC-PDA法测定。主要仪器为：Waters e2695型高效液相色谱仪系统，Waters e2996型二极管阵列检测器，Empower色谱工作站及数据处理系统；Beckman Coultcr高速离心机；MILLIPORE direct-Q纯水系统。色谱条件为色谱柱：Atlantis T3柱 （4.6×250 mm，5 μm）；柱温：35℃；流动相：体积分数为5%的甲醇水溶液，流速为 1.0 mL／min，进样量为 10 μL；检测器为二极管阵列检测器，扫描波长为190～460 nm。对照所用标准品采用的是国家菌草工程技术研究中心的冬虫夏草多糖肽标准品，纯度＞98%。

3.2.2 测定结果 取上述实施案例制备的冬虫夏草多糖肽纯品，经前处理后用HPLC-PDA检测并与标准品对照，结果显示为冬虫夏草多糖肽单峰（见图2和图3），无糖峰和肽峰分开出现的现象。此外，在扫描波长190～460 nm范围内，制备的冬虫夏草多糖肽纯品的最大吸收波长为192.3 nm，这也与标准品的最大吸收波长192.3 nm相同，双重定性可以确定制备所得确是冬虫夏草多糖肽。并经多次实验验证，利用本文所述的制备工艺所得冬虫夏草多糖肽纯度均在95%以上，因而可在测定冬虫夏草产品质量检测应用中用作对照品。

图2 冬虫夏草多糖肽标准品的色谱图

图3 冬虫夏草多糖肽纯品的色谱图

4 结 语

本文提出了一种制备冬虫夏草多糖肽的方法，此项研究国内尚未见报道。制备实验和HPLC测定结果显示，利用本文所述方法可以制备冬虫夏草多糖肽，且纯度＞95%，可用于冬虫夏草多糖肽制品如保健品的测定。

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