正交试验法优选消肿活血合剂的提取工艺

王琼珺，高伟城

（漳州卫生职业学院，福建 漳州363000）

消肿活血合剂源于漳州市中医院骨科的经验处方，由当归尾、赤芍、黄柏、陈皮、泽兰、苍术等10味中药制成，具有活血化瘀、消肿止痛之功。该方用于治疗跌打损伤和骨折初期所致的肢体肿胀、疼痛、瘀血等，临床运用几十年，疗效确切。该方以当归尾、赤芍为君药，活血化瘀，配合黄柏、泽兰、忍冬藤以清热凉血、散瘀消肿，以防损伤初期瘀血化热之证，共为臣药；用人中白、两面针、大丁癀托里定痛，祛瘀止血，为佐药；以陈皮、苍术为使药，固卫脾胃，以免克伐之弊。为控制产品的质量，稳定制剂的工艺，给患者提供更加安全有效的口服制剂，本实验采用正交试验法对原制剂的提取工艺进行优化，为生产工艺的确立提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AgiLent 1200高效液相色谱（包括真空脱气机、四元梯度泵、紫外检测器、自动进样器、Ver 08.01-Chemistation化学工作站）；电子天平 BP211D（1／100000 g），德国 Sartorius；电子天平 BSA4202S（0.01 g～4200 g），德国 Sartorius；电煎药锅，长沙市雨花区中诚制药机械厂；R201B旋转式蒸发仪，上海申生科级科技有限公司；KEJ-1000型超声波清洗机，张家港科净超声洗净设备有限公司。

1.2 试药 赤芍、当归尾、忍冬藤、两面针、大丁癀、泽兰、陈皮、黄柏、苍术、人中白，经漳州卫生职业学院中药教研室蔡扬帆副教授鉴定为合格药材。芍药苷对照品 （中国药品生物制品检定所，批号：110736-200732，纯度 98.1%）、甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA“天地”试剂公司）、超纯水（艾柯超纯水机）。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计 取消肿活血方（归尾40 g，赤芍 64 g，两面针 64 g，大丁癀 64 g，泽兰 64 g，陈皮40 g，黄柏 32 g，苍术 16.8 g，忍冬藤 64 g，人中白23.3 g）1／4 量药材，以加水倍数（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为考察因素，各因素设计3个水平，以芍药苷含量、干浸膏得率及综合评分为考察指标，按 L9（34）正交表安排试验［1-2］。 因素水平见表 1。

2.2 水煎提取试验 按处方量称取9份样品，按因素水平表和试验表，进行水煎煮提取。每份加水后浸泡1 h，煎液浓缩至250 mL。

2.3 干浸膏得率测定方法 精密移取提取液25.00mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃真空干燥3 h，移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，计算，即得［3］。结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 L9（34）水提取工艺正交试验结果

干浸膏得率＝（干浸膏重／11.8）×100%

2.4 芍药苷含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：zorbax SB C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相：甲醇-0.05 moL／L磷酸二氢钾（40∶60）；流速：1.0 mL／min；柱温：35℃；检测波长：230 nm；进样量：15 μL。芍药苷对照品、消肿活血合剂样品和缺赤芍的阴性对照样品的HPLC色谱图，见图1～图3。

2.4.2 线性关系考察 精密称取芍药苷对照品14.07 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL甲醇中含芍药苷276.05 μg的对照品母液。分别精密吸取对照品母液1、2、3、4、5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇制成不同浓度的对照品溶液。精密吸取15 μL，分别注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定。以对照品进样浓度（μg／mL）为横坐标X，相应峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，绘制标准曲线。芍药苷回归方程为：Y＝38.379X－25.571 （r＝0.9998）， 表明在11.042～55.210 μg／mL范围内呈良好的线性关系。

图1 芍药苷对照品HPLC色谱图

图2 消肿活血合剂样品HPLC色谱图

图3 阴性对照样品（缺赤芍）HPLC色谱图

采用的高效液相测定法方法验证结果：空白试验无干扰，加样回收率平均为99.4%，RSD＝0.75%（n＝6），表明方法准确度良好；对照品溶液精密度0.31%（n＝6），表明仪器的精密度良好；供试品溶液稳定性试验RSD为0.59%（n＝6），并且24 h基本稳定；重复性试验RSD值为0.91%，表明该方法的重复性良好。

2.4.3 供试品溶液的制备与测定 取消肿活血合剂1 mL至25 mL量瓶，加甲醇溶解，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液，即得。精密吸取15 μL进样，按标准曲线法计算芍药苷的含量。结果见表2。

2.4.4 综合评分 综合得分［4］＝［（芍药苷含量 ／最大值）×0.5＋（出膏率 ／最大值）×0.5］×100。

2.5 试验结果与方差分析 见表3。结果表明，影响芍药苷含量和干浸膏得率综合指标最大的因素是煎煮次数，其次是加水量，最后是煎煮时间。由方差分析表3可知：煎煮次数和加水量有显著性差异，提取时间无显著性差异。最佳提取条件为：提取条件C3A2B2。即最佳条件为煎煮3次，每次煎煮1.5 h。结合直观分析与实际生产，确定最佳水提取工艺为煎煮3次，加10倍量的水，每次1.5 h。

表3 试验结果方差分析表

2.6 工艺验证 结果3批样品芍药苷的含量分别为 885.21、884.62 和 884.35 μg／mL， 干浸膏得率分别为23.01%、22.98%和22.93%。表明正交试验选出的工艺条件合理，工艺条件稳定可行。

3 讨 论

3.1 当归尾具有补血活血之功效，为本方的君药。以含量测定指标成分代表性分析，当归尾中的阿魏酸最为适宜。原试验设计采用芍药苷含量、阿魏酸含量、干浸膏得率三者综合得分为指标。在测定归尾中阿魏酸含量时，阴性对照有干扰。赤芍其主要成分为芍药苷，具有解痉、镇痛、镇静、抗炎、抗溃疡等作用，亦为本方的君药，其含量可作为工艺优选的主要依据之一。故实验选用测定芍药苷的含量及干浸膏得率为综合指标考察水煎煮提取工艺。

3.2 《中华人民共和国药典》2010年版［3］及相关文献［1-2］中，芍药苷的测定波长均为230 nm，故本实验采用230 nm作为测定波长。

3.3 干浸膏得率对药效与制剂工艺有一定的影响，故选择总固体得率和处方中所含主要成分为提取工艺的综合指标。

3.4 处方原总量 472.1 g，共制 1000 mL，服用剂量每次25 mL，每天3次。由于总量较大，故试验时取1／4量，定量到 250 mL。

［1］赵慧萍.通脉合剂的制备及质量控制［J］.中药材，2008，31（12）：1913-1914.

［2］王志萍，韦慧鲜，申文慧.脑血栓片中芍药苷的定性定量测定［J］.时珍国医国药，2006，17（12）：2411-2412.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：96-97.

［4］王凌，徐玲玲，符德玉.丹蛭合剂提取工艺研究［J］.中成药，2008，30（7）：1064-1065.