活性维生素D3对IgA肾病大鼠肾组织中Toll样受体4表达的影响

王缨，汪国平，李弼民

（南昌大学第一附属医院肾内科，江西 南昌 330006）

·论著·

活性维生素D3对IgA肾病大鼠肾组织中Toll样受体4表达的影响

王缨，汪国平，李弼民

（南昌大学第一附属医院肾内科，江西 南昌 330006）

目的探讨活性维生素D3对IgA肾病（IgAN）大鼠保护作用的可能机制。方法50只大鼠随机分为3组，正常对照组（NC组）10只、对照模型组（MC组）20只、活性维生素D3治疗组（干预组）20只。干预组给予活性维生素D3灌胃8周。灌胃第4和8周末检测24 h尿蛋白定量、肾功能及血浆清蛋白，采用酶联免疫吸附测定血浆白细胞介素-1（IL-1）蛋白表达，免疫组织化学法检测肾组织Toll样受体4（TLR4）蛋白的表达。结果①与MC组比较，干预组血肌酐和24 h尿蛋白均下降（均P＜0.05）；②与NC组比较，MC组TLR4蛋白表达增加（P＜0.05）；与MC组比较，干预组TLR4蛋白表达下降（P＜0.05）；③与NC组比较，MC组IL-1表达增加（P＜0.05）；与MC组比较，干预组IL-1表达下降（P＜0.05）。结论活性维生素D3可通过抑制IgAN大鼠的TLR4的表达及细胞因子IL-1的表达，对IgAN大鼠肾脏损伤有预防保护作用。

IgA肾病；活性维生素D3；Toll样受体4；白细胞介素-1；大鼠

IgA肾病（immunoglobulin A nephropathy，I-gAN）是目前最常见的原发性肾小球疾病之一，IgAN典型的临床表现为黏膜感染，尤其是上呼吸道感染同时或之后短期内伴发肉眼血尿。因此，研究认为天然黏膜免疫异常在IgAN的发生中有一定的作用。天然免疫分子Toll样受体（toll-like receptor，TLRs）在天然免疫和获得性免疫中均起重要的作用。既往研究表明，TLR4通路与IgAN关系密切。近年活性维生素D3[1,25(OH)2D3]的肾脏保护作用受到关注，本研究探讨活性维生素D3对IgAN大鼠肾脏TLR4的表达的影响。现报道如下：

1 材料与方法

1.1试剂与药品

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、牛血清蛋白（bovine serum protein，BSA）、四氯化碳（CCL4）（均购自美国Sigma公司），Anti-TLR4 antibody一抗、二抗（美国anbo公司），活性维生素D3由为上海罗氏制药有限公司提供。

1.2实验动物与饲养条件

本实验所采用的50只大鼠均为SPF级雄性SD大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003。体重均在180～200 g，保证饲养环境的适宜，定时定量饮水、喂食，待大鼠适应环境7 d后开始构建大鼠IgAN模型。

1.3动物模型的构建及分组

50只SPF级别的SD雄性大鼠按随机数字表法分为两组，正常对照组10只、造模组40只。造模组大鼠用BSA按400 mg/kg隔日灌胃，至造模结束共9周；在第6及8周末通过尾静脉注射脂多糖，每只每次0.05 mg；每周日通过皮下注射CCL4，每只每次蓖麻油0.5 ml+CCL4 0.1 ml，共9周[1]；正常对照组（NC组）在相同时间给予正常对照组等体积蒸馏水灌胃，同体积生理盐水皮下注射及同等量的生理盐水尾静脉注射。实验第9周造模完成。造模完成后将40只模型组大鼠随机分为对照模型组（MC组）和干预组，每组各20只。MC组和干预组均继续予以BSA隔日灌胃（剂量同前），干预组给予1,25(OH)2D3溶于0.05 ml花生油以0.03μg/（kg·d）每日灌胃[2]，期间每周称量体重，根据体重的变化计算药物用量并作出调整。NC组和MC组大鼠每日灌喂同等量花生油，共8周。

1.4标本采集

于成模后及用药4和8周末对各组大鼠采用眶静脉采血法收集血液2～3 ml，静置2 h，3 000 r/min离心5 min，取血清，-80℃冻存待测；并于各实验点前用代谢笼留取各组大鼠24 h尿待测。于成模后及用药4和8周末每组大鼠各处死一半，留取其肾组织待测。

1.5观察指标与检测方法

1.5.1相关因子检测于成模后及用药4和8周，检测血肌酐（serum creatinine，Scr）、血白蛋白，检测24 h尿蛋白定量。

1.5.2组织病理学观察检查采用HE染色。免疫荧光检查：对IgA的沉积情况进行观察，并关注荧光的强度及面积，在肾小球系膜区显示为绿色视为阳性。

1.5.3肾组织TLR4蛋白的表达取肾组织标本，采用免疫组织化学检测，4μm厚石蜡切片，脱蜡后微波修复（柠檬酸缓冲液，pH 6.0），3%过氧化氢H2O2孵育10 min，3%BSA封闭15 min，滴加羊抗TLR4抗体（英国abcam公司，1∶800）后4℃过夜，次日滴加二抗（英国abcam公司），37℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次后，DAB显色，苏木素复染，透明，封片。以TLR4在肾小管上皮细胞、系膜细胞胞浆染成黄色或棕色为阳性。观察细胞染色阳性的强度及范围。以定量积分法对蛋白表达量进行评价，每张切片至少观察10个高倍镜视野。染色强度评分：浅黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分，染色阳性范围比例评分：1%～25%1分、26%～50%2分、51%～75%3分、76%～100%4分。以染色强度评分与阳性范围比例评分的乘积为TLR4阳性积分。

1.5.4IL-1蛋白表达取血清标本，采用酶联免疫吸附测定（emzyme-linked immuno sorbentassay，ELISA）法检测，将标准品、待测样本各50μl（待测样本10μl，再加样本稀释液40μl）加入到已包被的酶标板，37℃恒温箱温育30 min，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液50μl，37℃恒温箱温育30 min，洗涤除去未结合的成分，依次加入底物工作液50μl，每孔加终止液50μl混匀，450 nm波长下测定OD值。酶标仪的读数为每孔样品和标准品的OD值，且可测出具体浓度数值，根据标准品的浓度和所测OD值求得标准曲线，再根据所得样品OD值和标准曲线公式算出实测样品的浓度值。

1.6统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 13.0统计学分析软件，单因素方差分析比较多组间均值的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般情况

MC组在造模第4周时死亡大鼠1只，造模第7周时死亡大鼠1只；干预组1,25(OH)2D3治疗4周时死亡大鼠1只。

在整个实验过程中，对照组大鼠精神、活动无明显异常，造模组部分大鼠在造模第6和8周尾静脉注射LPS后，出现食欲不振或精神萎靡等，但一般1周后可自行缓解。

2.2各组大鼠不同时间点Scr、血浆清蛋白和24 h尿蛋白比较

Scr、血浆清蛋白和24 h尿蛋白MC组各时间点与NC组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；干预组第4和8周与MC组同时间点相比差异有统计学意义（P＜0.05）；干预组第8周与第4周相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠生化结果的比较（±s）

表1 各组大鼠生化结果的比较（±s）

注：1）同一时间点，与NC比较，P＜0.05；2）同一时间点，与MC组相比，P＜0.05；3）同一时间点，与干预组4周比较，P＜0.05

8周例结果24 h尿蛋白（mg/24 h）对照组104.65±0.41104.66±0.9054.90±0.40模型组干预组组别0周例结果结果4周例18 20 14.33±0.731）14.38±0.961）18 19 16.87±0.861）13.0±0.891）2）9 9 17.22±0.451）10.1±0.801）2）3）Scr/（μmol/L）对照组模型组干预组10 18 20 36.04±4.26 51.10±5.041）50.33±4.251）10 18 19 36.53±3.51 62.97±6.851）48.53±4.261）2）5 9 9 35.27±4.21 70.09±4.861）40.74±3.841）2）3）血清蛋白/（g/L）对照组1033.27±2.231033.32±2.73534.01±2.54模型组干预组18 20 26.59±1.531）26.14±1.511）18 19 23.28±2.071）27.16±1.581）2）9 9 21.44±1.431）29.50±1.661）2）3）

2.3光镜和荧光显微镜下各组大鼠肾脏病理组织学观察

光镜下NC组大鼠未见病理改变，MC组在肾小球内可见明显的系膜细胞增多，系膜基质中到重度增生，毛细血管管腔狭窄，肾间质内可见明显的炎性细胞浸润，并可见肿胀变性的肾小管上皮细胞。见图1。荧光下NC组未见IgA沉积，MC组可见团块状或颗粒状绿色IgA荧光。见图2。

图1 NC组和MC组大鼠肾组织病理改变（光镜×400）

图2 NC组和MC组大鼠肾组织中IgA的沉积（免疫荧光×400）

2.4TLR4的免疫组织化学染色

TLR4蛋白表达MC组各时间点与NC组比较差异有统计学意义（P＜0.05），干预组各时间点与MC组相比差异有统计学意义（P＜0.05），干预组8周时TLR4的表达较4周时明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3和表2。

表2 各组大鼠TLR4蛋白定量的比较（分，x±s）

表3 各组大鼠不同时间点IL-1蛋白表达水平比较[ρ/（ng/L）±s]

表3 各组大鼠不同时间点IL-1蛋白表达水平比较[ρ/（ng/L）±s]

注：1）与NC组相比，P＜0.05；2）与MC组相比，P＜0.05；3）与干预组4周比较，P＜0.05

组别4周8周例定量积分例定量积分NC组105.68±2.1257.13±3.24 MC组1961.15±35.461）975.31±59.121）干预组1841.13±15.21920.43±8.932）3）

2.5IL-1蛋白表达

大鼠IgAN模型构建成功后，炎性因子IL-1表达上调，并随着疾病进展表达进一步增加。MC组与NC组同时间点相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）；干预组8周时IL-1表达较MC组同时间点有明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。干预组8周时IL-1的表达较4周时明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

图3 3组大鼠肾组织中TLR4的表达（免疫组织化学×400）

3 讨论

IgAN的典型临床表现是上呼吸道感染的短期内出现肉眼血尿或镜下血尿，可伴有不同程度的蛋白尿。研究报道，上呼吸道或扁桃体感染可增加IgAN患者的血尿和蛋白尿。扁桃体摘除可有效治疗某些IgAN患者，说明天然黏膜免疫异常可能参与了IgAN的发生发展过程。

TLR是一种模式识别受体，目前TLR家族有11个成员，可识别环境中的病原体，启动天然免疫和适应性免疫应答产生不同的效应分子，抵抗病原体的入侵，作为TLR家族中及其重要的成员TLR4在天然免疫反应中有十分重要的作用，黏膜感染时LPS可激活TLR4，其主要信号转导途径之一是通过一个衔接蛋白（MyD88）与TLRs细胞内TIR区域结合，导致转录因子（如NF-κB）的激活，从而促使大量细胞活性因子（IL-1、IL-6和IL-8）、黏附分子和炎症因子的合成及转录表达，最终影响免疫与炎症反应[3-6]。TLRs家族中TLR4除了介导细菌内毒素所致的炎症反应外，还可介导肺脏、肝脏及肾脏IRI等非感染性炎症反应，通过抑制TLR4活性可以起到一定的脏器保护作用[7-9]。

越来越多的研究表明：TLR4信号通路与肾脏疾病密切相关，对肾毒性肾炎模型的研究发现，TLR4配体通过对外周淋巴细胞及肾固有细胞的调控作用，在肾小球肾炎的发展中起重要作用[10]。COPPO等[11]发现IgAN患者外周血单核细胞中TLR4表达增加，且与尿蛋白及疾病活动时期相关。QIN等[12]发现细菌LPS激活TLR4可以导致Cosmc的甲基化，从而降低IgA1的糖基化程度，提示在IgAN的发生发展中，TLR4也起到一个重要的作用。

研究表明TLR4可能通过多种机制激活多种配体参与IgAN患者肾组织损伤[13-14]。TLR4信号通路激活后可引起相关细胞因子表达上调，导致肾组织炎症反应，损伤的肾组织又可暴露纤维蛋白原及黏连蛋白等TLR4内源性配体，诱导TLR4的表达，形成恶性循环[15]。本研究通过构建大鼠IgAN模型，检测TLR4在肾组织中表达较正常对照组明显增加，主要表达于肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞中，提示在IgAN的发病中，TLR4信号通路是一个重要途径。在2型糖尿病患者中研究发现TLR4表达增加，且与内毒素HSP60及HMGB1呈正相关，TLR4信号导致细胞因子水平升高，这其中就包括了IL-1[16]。本研究也观察到IgAN大鼠中IL-1和TLR4有较大关联，随着TLR4的表达增加上调了IL-1在体内的表达而引起炎症反应。

活性维生素D3不仅是调节体内钙磷代谢平衡的重要激素，活性维生素D3可通过通过阻断肾素-血管紧张素系统、直接抑制炎症因子分泌、调节免疫、减少细胞外基质沉积和保护足细胞等对肾脏起到保护作用[17-19]。LI[17]研究活性维生素D3也能抑制肾成纤维细胞的增殖和转化，具有抗系膜细胞增殖的活性，减轻肾间质纤维化，对肾脏起保护作用，延长患者生存率。BAEKE等[20]研究发现，活性维生素D3能够抑制单核细胞的TLR4 mRNA和蛋白的表达，且该作用呈时间和剂量依赖性。PANICHI等[21]的研究表明活性维生素D3具有抑制IL-1、IL-6及TNF-α等递质的作用，从而能够显著减少系膜增生性肾小球肾炎大鼠模型的蛋白尿。由上可知，活性维生素D3具有阻抑慢性肾脏疾病进行性发展的潜能。本研究结果显示，应用活性维生素D3干预治疗后可以减少IgAN大鼠尿白蛋白排泄率，改善肾功能，减轻肾脏的病理改变，肾组织中TLR4的表达较模型组明显下降，其炎性因子IL-1的表达同时间点较模型组有所下降。其作用机制可能是通过TLR4路径抑制炎性因子的表达。因此，可以进一步以TLR4为靶点，阻断或抑制其表达，观察TLR4的具体变化，寻找表达变化中的关键环节，并针对关键因素进行临床研究，可能为临床药物开发提供新的思路。

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（张立芳 编辑）

Effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on renal expression of TLR-4 in IgAN rats

Ying WANG,Guo-ping WANG,Bi-min LI
(Department of Nephrology,the First Affiliate Hospital of Nanchang University, Nanchang,Jiangxi 330006,P.R.China)

【Objective】To explore possible renal protective effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on IgAN rats.【Methods】Fifty rats were randomized into 3 groups,the normal control group(group NC)(n=10),IgAN group (group MC)(n=20),IgAN rats treated with 1,25-dihydroxyvitamin D3(Intervention group)(n=20).After 4 and 8 weeks treatment,24 h urine protein,serum creatinine and serum albumin were detected.ELISA was used to monitor the expressions of interleukin-1(IL-1)protein in plasma.Immunohistochemical staining was used to monitor the expressions of Toll-like receptor 4(TLR4)protein in renal tissue.【Results】①24 h urine protein and serum creatinine in the intervention group were significantly lower than those in the MC group(P<0.05);②TLR4 protein expression in MC group was significantly higher than that in NC group(P<0.05),and the expression in the intervention group was significantly lower than that in MC group(P<0.05);③IL-1 expression in the MC group was significantly higher than that in NC group(P<0.05);IL-1 expression in the intervention group was significantly lower than that in MC group(P<0.05).【Conclusion】1,25-dihydroxyvitamin D3 has some renal protective effect on IgAN rats, partly by down-regulating TLR4 in renal tissue.

IgAN;1,25-dihydroxyvitamin D3;Toll-like receptor 4;interleukin-1;rat

R-332；R692

A

1005-8982（2015）25-0025-05

2014-12-17

李弼民，E-mail：lbmjx@163.com