木补对心肌缺血大鼠ST段及Omentin－1/iNOS和TGF－β1/JNK通路的影响

杨 雅，刘 霞

凉山州第二人民医院（西昌 615000）

心肌缺血是由心脏血液灌注减少导致心脏供氧不足的一种病理状态，其常见诱因为冠状动脉阻塞、血液黏度增高、超氧阴离子和氧自由基引起的过氧化损伤等［1］。 木补即异叶泽兰（Eupatorium heterophyllumDC.）［2］，多年生草本，甘苦微温之品，泽兰属，主产于凉山州地区。《双柏彝医书》及现代《云南中草药》记载，木补为一种常用的活血化瘀中草药，毒副作用小。资料［3］显示，泽兰的主要化学成分为迷迭香酸、熊果酸、齐墩果酸、胡萝卜苷、原儿茶酸、乙酰熊果酸、咖啡酸和香茶菜素等酚酸类，具有扩张微血管、改善微循环、增加红细胞流动性、拮抗血栓形成以及降低血液黏度等药理作用，因而其可能成为一种新的治疗心肌缺血的民族特色药物。本研究通过观察心肌缺血大鼠ST段改变及血清网膜素－1（Omentin－1）和血浆转化生长因子β1（TGF－β1）相关指标的变化，探讨彝药木补对心肌缺血大鼠的治疗作用，并采用 Western－blot法对心脏内JNK1/2和iNOS蛋白的表达进行检测，旨在揭示彝药木补治疗心肌缺血大鼠的可能机制，以期为心肌缺血的防治提供新的中草药依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠30只，雌雄兼用，月龄3个月，体质量250～300g，购自四川大学华西医学中心实验动物中心，合格证号：SCXK（川）2014～6。

1.2 实验药物及主要试剂仪器

彝药木补购自凉山州中药材有限责任公司；戊巴比妥钠购自上海江莱生物科技有限公司；垂体后叶素（Pit）购自美国Promega公司；大鼠 Omentin－1 ELISA Kit购自 R＆D公司；大鼠 TGF－β1ELISA Kit购自美国GBD公司；牛血清白蛋白购自美国Sigma 公司；p－JNK1/2 兔源一抗购自美国NovusBiologicals公司；iNOS兔源一抗购自美国santacruz公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG购自北京博尔西科技有限公司；ELx酶标仪由美国Bio－Tek Instruments Inc公司生产；心电图机由SCHILLER AG公司生产；旋转蒸发仪由德国Heidolph生产；电泳仪和转膜仪由上海俊仕生物科技有限公司提供；高速冷冻离心机由北京泰泽瑞达科技有限公司提供。

1.3 彝药木补水煎剂的制备

准确称取彝药木补100g，双蒸水浸泡，文火煎煮，多层纱布过滤，旋转蒸发仪浓缩成1g生药/mL，除菌后4℃保存。

1.4 分组给药

将30只SD大鼠随机分成正常对照组、心肌缺血模型组、木补低剂量组［0.8g生药/（kg·d）］、木补中剂量组［2g生药/（kg·d）］和木补高剂量组［4 g生药/（kg·d）］。各给药组大鼠灌服不同浓度的木补水煎剂，连续给药6d，正常对照组及心肌缺血组灌服等量生理盐水。

1.5 心肌缺血模型制备

各组大鼠干预处理6d后，腹腔注射2%的戊巴比妥钠（0.2mL/100g）麻醉。固定并记录各组大鼠注射Pit前的心电图，10min后除正常对照外其余各组大鼠尾静脉注射Pit（1.5U/kg），正常对照组注射等量生理盐水。记录注射Pit后10min时各组大鼠的心电图变化情况，计算注射Pit后10 min时各组心电图ST段的上移幅度均值。

1.6 ELISA法检测Omentin－1、TGF－β1的变化

各组大鼠于注射Pit后20min心脏采血，用于ELISA检测。做3次生物学重复。

1.7 Western－blot法检测iNOS和p－JNK1/2的表达

各组大鼠注射Pit后20min，取大鼠心脏。提取心脏总蛋白并定量后，进行SDS－PAGE电泳，电印迹转移法转膜，5%蛋白封闭液摇床封闭2h，4℃过夜孵育一抗（稀释度1∶1 000），TBST洗膜6次；HRP标记的二抗（稀释度1∶5 000）摇床孵育45 min，TBST洗膜6次，ECL法显色、曝光，暗室洗片，并进行数据分析。做3次生物学重复。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0软件分析实验数据，用均数±标准差（±s）表示，用t检验比较组间数据，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量木补对心肌缺血大鼠模型心电图的影响

心肌缺血模型组大鼠注射Pit后10min，ST段上移幅度为（0.67±0.03）mV，正常对照组ST段无变化，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。低、中、高剂量木补连续灌服大鼠6d后，与心肌缺血模型组比较，中、高剂量木补均能显著降低心肌缺血大鼠ST段上移幅度（P＜0.05）（表1）。

表1 不同剂量木补对心肌缺血大鼠ST段上移幅度的影响（mV）

2.2 不同剂量木补对心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影响

各组大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型组Omentin－1和TGF－β1分泌量分别为30.81ng·L－1和143.41ng·L－1，正常对照组 Omentin－1和 TGF－β1分泌量分别为67.13ng·L－1和71.74ng·L－1，两组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.05）。低、中、高剂量木补连续灌服大鼠6d后，与心肌缺血模型组进行比较，高剂量木补能升高心肌缺血大鼠血清Omentin－1水平（P＜0.05）；中、高剂量木补能够显著降低心肌缺血大鼠血浆TGF－β1（P＜0.05）（图1）。

图1 不同剂量木补对心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影响

2.3 不同剂量木补对心肌缺血大鼠iNOS和p－JNK1/2蛋白表达的影响

各组大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型组大鼠JNK1/2磷酸化水平提高，iNOS表达水平降低，与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；低、中、高剂量木补连续灌服大鼠6d后，与心肌缺血模型组比较，高剂量木补能显著降低心肌缺血大鼠心脏JNK1/2的磷酸化水平（P＜0.05），也能显著升高心肌缺血大鼠iNOS表达量（P＜0.05）（图2）。

图2 不同剂量木补对心肌缺血大鼠p－JNK1/2、iNOS蛋白表达的影响

3 讨论

近年来临床实践［4］发现，中草药可通过抑制化学趋化因子产生、调节转化生长因子水平、提高血液NO分泌量以及促进相关脂肪因子表达等方式治疗心肌缺血。彝药木补的化学成分主要为酚酸类及三萜酸类化合物，能活血化瘀、扩张血管活性，对心血管疾病可能有较好的治愈作用。基于此，本研究通过建立大鼠心肌缺血模型，以大鼠心电图ST段改变及血液活性因子为研究指标，阐明彝药木补的抗心肌缺血功效。冠状动脉阻塞引起的心脏供血不足是导致ST段抬高的主要诱因，并可进一步演化为心肌损伤、心肌微循环障碍、心律失常以及心肌舒缩障碍等病理特征，其中ST段抬高是心肌缺血患者血液灌注异常的主要临床表现［5］，因此及时监测其心电图ST段变化情况，合理降低其ST段上移幅度，可有效控制和治疗疾病。本研究实验结果显示，尾静脉注射Pit，模型组大鼠ST段抬高幅度显著高于正常对照组，表明心肌缺血模型制备成功。给予中、高剂量彝药木补预处理6d后，能显著降低心肌缺血大鼠心电图ST段抬高幅度，提示彝药木补可改善心肌缺血大鼠心电图体征，并控制其病程的恶化。为揭示彝药木补降低心肌缺血大鼠心电图ST段抬高幅度的可能机制，本研究拟以血清Omentin－1和血浆TGF－β1作为研究对象，分别对心肌缺血大鼠 Omentin－1/iNOS系统和 TGF－β1/JNK1/2通路进行探讨。

Omentin即脂肪因子，是一种分泌蛋白，有Omentin－1和 Omentin－2两种亚型，其中 Omentin－1可与血管内皮相应受体结合，激活体内iNOS蛋白活性，从而促进血管内NO产生，能改善血管内皮细胞功能、抑制血管钙化形成、促进血管再生、恢复毛细血管密度活性，从而广泛参与对心血管疾病的调控过程［6］。Zhong等［7］研究表明，冠状动脉疾病患者Omentin－1水平较健康组低，与本实验结果相符。本实验结果显示，高剂量木补可显著提高心肌缺血大鼠Omentin－1分泌量、iNOS蛋白表达量，提示彝药木补可通过调节心肌缺血大鼠Omentin－1分泌水平，进而刺激心脏iNOS蛋白表达，从而增加血液中NO的释放量，清除超氧阴离子和过氧自由基，抑制NADPH氧化酶活性，减少氧化损伤，以改善心肌缺血症状。

TGF－β1是一种由血管内皮细胞、心肌细胞等分泌的具有广泛生物学功能的生长因子，是调节细胞增殖、凋亡的重要因素［8］，它可能与心肌缺血等心血管疾病的发生发展有关。TGF－β1活化后可与细胞膜表面的二聚体受体结合，激活ⅳ型受体，磷酸化R－Smads分子C末端的丝氨酸残基，传导胞外信号，持续激活体内JNK活性，从而调控若干下游靶分子，不断扩大信号级联反应，促进心肌缺血损伤［9］。进一步对 TGF－β1介导的JNK1/2信号通路是否参与心肌缺血损伤进行探讨，研究［10］表明，TGF－β1水平与心肌缺血等冠状动脉疾病有关，可作为预测心肌缺血的重要临床指标。同时Strand等［11］发现，体内JNK1/2的磷酸化对 TGF－β1的分泌具有正调控作用。本实验结果显示，彝药木补预处理大鼠后，血浆TGF－β1分泌水平和体内JNK1/2的磷酸化程度均显著降低，并呈现剂量依赖性，表明彝药木补可通过抑制JNK1/2的磷酸化调节TGF－β1的分泌量，从而改善心肌缺血症状。

综上所述，Pit介导的大鼠心电图ST段抬高幅度的增加，可能与 Omentin－1和 TGF－β1的表达水平有关。彝药木补可通过调节心肌缺血大鼠体内iNOS和JNK1/2蛋白活性，控制血清细胞因子的分泌，从而促进心肌缺血转归，但对彝药木补改善心肌缺血作用的具体机制仍需进一步研究。

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