溃疡性结肠炎患者肠道菌群分析和细菌毒素基因检测*

牛 敏，邵天波，陈瑞春，杜 艳

昆明医科大学第一附属医院检验科昆明650000

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性结肠炎症，临床症状有腹痛、腹泻、黏液血便等［1］，目前尚无法完全治愈。UC 在北美和欧洲患病率高于亚洲国家［2］。近年来，其在我国的患病率呈现逐渐增加的趋势，目前约为11．6/105［3-4］。UC 致病机制复杂，包括遗传易感性、免疫调节异常、肠黏膜屏障功能障碍和肠道微生态改变等［5］。研究显示，UC 患者存在不同程度的菌群失调［6-8］，某些条件致病菌在UC 患者肠道中的检出率明显高于健康人群［9-11］。肠道致病菌的毒素基因一般不表达，只有被诱导激活后，才产生大量毒素，引起肠道炎症及腹痛腹泻等症状［12-14］。该研究收集明确诊断的UC 患者和正常人的新鲜粪便标本，首先进行肠道菌群分布的分析，然后检测粪便中多种常见条件致病菌毒素基因，为UC 的发病机制和益生菌治疗的研究提供依据。

1 材料与方法

1．1 标本来源 53例UC 确诊病例来自昆明医科大学第一附属医院2012年至2013年消化科住院患者，经结肠镜及病理检查，符合2007年中华消化学会制定的《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》的诊断标准［4］。根据疾病活动指数，活动期32例，男17例，女15例，年龄(47．7 ±13．0)岁;缓解期21例，男14例，女7例，年龄(45．9 ±13．0)岁。45例对照为该院2012年至2013年体检中心体检健康者，男27例，女18例，年龄(45．8 ±12．2)岁，无消化道慢性疾病史，常规体检和粪便常规检查均未见异常。所有研究对象留取标本前4 周内均未应用抗生素或微生态制剂等可能影响肠道菌群的药物。采集新鲜粪便标本10 g，2 h 内直接涂片并接种于哥伦比亚血平板和麦康凯平板;另留取200 mg 置于－80℃冰箱保存，以待细菌毒素基因的检测。

1．2 主要仪器和试剂

1．2．1 仪器 Nikon50i 显微镜图文系统(日本Nikon 公司)，VITEK 2 全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃公司)，MyCyclerTMthermal Cycler DNA 扩增仪(美国Bio-Rad 公司)等。

1．2．2 试剂 哥伦比亚血平板和麦康凯平板(郑州安图绿科生物工程有限公司)，革兰染液、厌氧气体发生袋、GN 鉴定卡、GP 鉴定卡和API 20A 厌氧菌鉴定卡(法国梅里埃公司)，粪便DNA组提取试剂盒(离心柱型)、HotMaster PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)，引物合成由上海Invitrogen 公司完成。

1．3 直接涂片镜检和菌群分析 新鲜粪便涂片，面积约1．5 cm ×2．0 cm，厚度如血膜的菌膜，干燥固定后革兰染色，油镜下观察10个视野，根据每油镜视野细菌总数和各类细菌比例，判断是否存在菌群失调及菌群失调程度，判断和分级标准参照《肠道菌群粪便涂片检查图谱》［15］。

1．4 细菌培养鉴定 用10 μL 接种环挑取一环粪便标本，采用四区划线的方法进行接种。①需氧培养:接种血平板和麦康凯平板，在含体积分数5%CO2、37℃有氧环境中孵育24 h。使用VITEK 2 全自动细菌鉴定仪对血平板上生长的优势菌进行菌种鉴定。用麦康凯平板筛查沙门菌和志贺菌。②厌氧培养:接种厌氧血平板，在37℃无氧环境中(厌氧气体发生袋)孵育48 h，挑取优势菌做耐氧试验，专性厌氧菌用API 20A 厌氧菌鉴定卡鉴定。

1．5 细菌毒素基因的检测 采用粪便DNA组提取试剂盒(离心柱型)抽提粪便总DNA，具体方法按试剂盒说明书操作。提取的DNA 于－20℃保存。待测的毒素基因包括:肠侵袭型大肠埃希菌(EIEC)毒力因子vira 基因，肠产毒型大肠埃希菌(ETEC)的热不稳定毒力因子LT 基因，产气荚膜梭菌外α 毒素(cpa)基因，拟杆菌肠毒素bft 基因，艰难梭菌毒素A(cdtA)基因，艰难梭菌毒素B(cdtB)基因，引物序列见表1。扩增体系:Mix 12．5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，水9．5 μL。扩增条件:95℃预变性15 min;95℃变性10 s，58～64℃退火、延伸30 s，40个循环。退火温度分别为:GAPDH 62℃，vira 64℃，LT 62℃，cpa 61℃，bft 63℃，cdtA 60℃，cdtB 58℃。扩增反应体系和退火温度参考文献［16］。扩增产物用20 g/L 琼脂糖凝胶电泳纯化后送上海生工生物工程有限公司进行双向测序，将测序结果进行BLAST 比对。

1．6 统计学处理 采用SPSS 19．0 进行统计学分析，涂片菌群失调率、细菌优势生长率、毒素基因检出率的比较采用χ2检验或精确概率法，涂片菌群失调程度分析采用秩和检验;检验水准α=0．05。

表1 引物序列

2 结果

2．1 菌群分析 UC 活动期组菌群失调率为87．5%(28/32)，UC 缓解期组为81．0%(17/21)，对照组为53．3%(24/45)，3组比较，差异有统计学意义(χ2=11．904，P=0．003);UC 活动期组与UC 缓解期组比较，差异无统计学意义(P =0．698);UC 活动期组高于对照组(χ2=9．957，P =0．003)，UC 缓解期与对照组比较，差异无统计学意义(χ2= 0．424，P=0．515)。UC 活动期组菌群失调严重程度高于UC缓解期组，见表2。

表2 UC 活动期和缓解期组菌群失调程度的比较例

2．2 细菌培养与鉴定

2．2．1 需氧培养 优势菌见表3。3组大肠埃希菌和条件致病菌优势生长率差异有统计学意义。UC组总的大肠埃希菌优势生长率(66．0%)明显低于对照组(88．9%，χ2=7．075，P=0．008)，条件致病菌优势生长率(32．1%)明显高于对照组(11．1%，χ2=6．144，P=0．013)。

2．2．2 厌氧培养 优势菌见表4。3组大肠埃希菌、益生菌和条件致病菌优势生长率差异均无统计学意义。

表3 3组需氧培养的优势菌例

表4 3组厌氧培养的优势菌例

2．3 细菌毒素基因的检测 6种细菌毒素基因在3组标本中均有检出，PCR 电泳图见图1。与BLAST比对结果显示，产物片段没有缺失，序列100%比对成功。各毒素基因检出率见表5。由于各毒素基因检出率较低，因此，统计了6种毒素基因的总检出率。UC组毒素基因总检出率(41．5%)高于对照组(22．2%，χ2=4．117，P =0．042)，但UC 活动期组(40．6%)与缓解期组(42．9%)比较，差异无统计学意义(χ2=0．451，P=0．502)。

表5 3组各毒素基因的检出率例

图1 各毒素基因PCR 电泳图

3 讨论

UC 的致病机制复杂，肠道菌群失调可能是诱发和维持结肠炎症的主要原因［17］。该研究中，作者首先通过涂片镜检发现UC 活动期组菌群失调率明显高于对照组，UC 活动期组菌群失调程度也明显高于缓解期组，提示UC 患者肠道菌群状况与病情发展密切相关，缓解期患者结肠炎症的复发可能与肠道菌群失调的加重有关。

粪便需氧培养结果显示，变形杆菌属、克雷白杆菌属、阴沟肠杆菌、肠球菌属和溶血性链球菌等条件致病菌在UC组中的优势生长率明显高于对照组。上述条件致病菌数量的增多可能与UC 相关，但是否与患者病情相关仍不明确。厌氧培养结果显示，3组大肠埃希菌、益生菌及条件致病菌的优势生长率差异均无统计学意义。但值得注意的是，UC 患者中共检出7例梭菌属优势生长，这与Andoh 等［7］的研究结果相反，因此UC 与梭菌属的关系还有待进一步研究。培养结果表明，UC 患者肠道条件致病菌增多，存在菌群失调，与涂片分析结果一致。

细菌毒素基因检测结果显示，LT 基因只在UC组中检出，检出率为5．56%，提示产毒型大肠埃希菌可能与UC 关系密切。各毒素基因在UC组和对照组中检出率均较低，但是UC 患者粪便中毒素基因的总检出率高于对照组，提示UC 患者肠道中多种条件致病菌的毒素基因共同存在，容易形成菌群失调，与培养结果一致。

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