瑞芬太尼聚己内酯对脊髓缺血再灌注损伤兔体感诱发电位的影响*

方 华，章建平#，张竞超，章放香，王泉云，王儒蓉，刘 进

1)贵阳医学院附属人民医院麻醉科 贵阳550002 2)四川大学华西医院麻醉科 成都610041

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)是引起继发性脊髓损伤的重要机制［1-2］。SCIRI 引起的轻瘫或截瘫发生率高达21%［3］。目前，SCIRI 发生的病理生理机制尚未完全阐明。瑞芬太尼聚己内酯(remifentanil-poly-caprolactone，REM-PCL)是由方华等［4］自行研制开发并已获得国家正式授权的一种新型高分子Mu 阿片受体(Mu-opioid receptor，MOR)激动剂，前期研究已证实腹主动脉内灌注REM-PCL 0．1 mg/kg 预处理可能对SCIRI 具有重要的治疗价值。为了进一步研究REM-PCL 对神经系统的保护机制，该研究观察了SCIRI 模型兔腹主动脉内局部灌注REM-PCL 后体感诱发电位(somatosensory-evoked potential，SEP)的变化规律，并通过神经行为学评估和脊髓组织病理学观察，探讨REM-PCL 的脊髓保护作用。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 REM-PCL(中国发明专利号:200810045272．8)，阿片受体拮抗剂GSK1521498(美国Sigma 公司)，均溶解于5 mL 生理盐水中。神经元特异性烯醇化酶(NSE)ELISA 检测试剂盒(美国USCNLIEF 公司)，RevertAidTM第一链cDNA 合成试剂盒(美国Fermentas 公司)，BL-420S 生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，PCR 引物、β-actin 及3S Trizol 总RNA 提取试剂盒(上海博彩生物科技有限公司)。

1．2 SCIRI 动物模型的建立 采用左肾动脉下方腹主动脉夹闭法建立SCIRI 兔模型。经耳缘静脉按30 mg/kg 的剂量注射戊巴比妥钠麻醉兔后，右股部褪毛、常规消毒、铺巾，逐层切开暴露，仔细分离并显露右侧股动脉，经右侧股动脉向腹主动脉内置入硬膜外导管，使导管远端位于左肾动脉起始点下方1 cm 处，固定导管，接传感器测压。置管前5 min 经耳缘静脉注射肝素1 mg/kg。左腹股沟区备皮，消毒铺巾，腹正中开腹后显露腹主动脉及左肾动脉，并于左肾动脉分支下方约0．5 cm 处用动脉夹夹闭腹主动脉。证实股动脉平均动脉压波形变为直线后，阻断腹主动脉血流以造成腰段脊髓缺血损伤。阻断45 min 后松钳开放腹主动脉，恢复脊髓血液灌注，以造成腰段脊髓再灌注损伤。血压稳定后，取出导管，结扎右侧股动脉，见腹主动脉搏动恢复、无血管严重损伤及腹腔渗血后，予甲硝唑10 mL 冲洗腹腔预防感染，确切止血，逐层关腹，观察24 h。术中以生理盐水浸润的温纱垫覆盖腹腔脏器，直肠温度维持于36～37℃。

1．3 实验分组及处理方法 健康新西兰大白兔30只(四川大学实验动物中心提供)，雌雄不限，体重2．0～2．5 kg，手术当日晨禁食，按照随机数字表法分为对照组、REM-PCL (R)组和 REM-PCL +GSK1521498组(RG组)，每组10只。R组和RG组按1．2 方法制备SCIRI 动物模型;对照组麻醉后仅进行手术操作，不阻断腹主动脉。R组和RG组阻断腹主动脉血流时，经腹主动脉局部灌注REM-PCL 0．1 mg/kg，5 min 内灌注完毕;RG组于REM-PCL 灌注结束后15 min 时再局部灌注GSK1521498 1 mg/kg，5 min 内灌注完毕;对照组局部灌注等容量生理盐水。术中采用i-STAT 血气分析仪(美国)间断测定动脉血气，连续监测经皮脉搏氧饱和度、心电图、平均动脉压及直肠温度。

1．4 观察指标

1．4．1 SEP 测量 采用BL-420S 实验系统，于阻断前，再灌注15、30、60 min 及再灌注24 h 时测定SEP。刺激:将两根直径0．5 mm 单极银针电极间距2．5 cm 插入左小腿腓肠肌，进行电脉冲刺激;刺激频率4 Hz，强度5 mA。记录:用ST-7 型脑立体定位仪固定兔头部，颅骨正中矢状线上17．5 mm、向右侧旁开3．5 mm 处采用牙科钻钻开一直径为3．0 mm的圆孔，显露硬脑膜(相当于左后肢感觉投射区)，并将直径2．0 mm 无菌单极银球记录电极安放至圆孔内，保持电极与硬脑膜接触良好且不损伤脑组织。SEP 起始潜伏期(OL)的记录为刺激开始至P1 波波峰出现的时间，单位为ms;SEP 峰间波幅(IPA)为N1 波波峰至P1 波波谷的幅度，单位为μV;观察SEP 形态(即波形)，包括各波的时空分布、位相和出现率。实验结束后还原颅骨瓣并缝合头皮。

1．4．2 血清NSE 的检测 各组分别于阻断前，再灌注15、30、60 min 及再灌注24 h 时自股静脉采血5 mL，5 000 r/min 离心后取上清，采用双抗体夹心ELISA 法测定血清NSE 质量浓度。

1．4．3 神经行为学评定 于再灌注6、12 和24 h时，由不了解分组情况的两名观测者进行动物后肢感觉、运动反射功能评估及神经功能评分，每例均测试3次，取其平均值。根据Reuter 等评分标准［5］进行综合评价。

1．4．4 后角神经元计数 再灌注24 h 时，神经行为学评定完成后，再次麻醉兔，迅速完整取出L3～L4 节段脊髓组织固定于福尔马林中，常规HE 染色，采用Olympus BX51 图像采集分析系统等距随机抽样法观察脊髓组织病理学变化，参照文献［6］计数脊髓后角(Ⅰ～Ⅵ区)正常和异常感觉神经元，并计算感觉神经元异常率。神经元异常率=所选视野中异常神经元数/该视野中神经元总数×100%。

1．4．5 MOR mRNA 的表达 再灌注24 h 时，神经行为学评定完成后，采用实时荧光定量PCR 法检测脊髓组织中MOR mRNA 的表达。使用Primier 5．0软件，根据PubMed 中基因序列设计MOR、β-actin的引物和探针。MOR 探针:5'-CTACAACATGTTC ACCAGCATCTTCACGCTCACCA-3'，MOR 正向引物:5'-AAGGCTGTGCTCTCCATTGAC-3'，MOR 反向引物:5'-CCCAACACCTGAAGCCAAGAC-3'。β-actin 探 针:5'-CAACGAGCGGTTCCGATGCCCT-3'，β-actin 正向引物:5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，β-actin 反向引 物:5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3'。定 量方法参照文献［7］。

1．5 统计学处理 采用SPSS 16．0 进行统计处理。3组SEP、神经行为学评分和血清NSE 质量浓度的比较采用重复测量的方差分析，3组MOR mRNA 表达和感觉神经元异常率的比较采用单因素方差分析和SNK-q 检验，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 术后动物一般情况观察 手术结束2 h 内动物均完全清醒。实验过程中，实验动物均无意外死亡，手术切口均愈合良好，无感染。对照组、R 和RG组截瘫率分别为10/10、5/10 和8/10。

2．2 SEP 变化 见表1。再灌注后，3组兔SEP OL均延长，IPA 均降低。R组IPA 于再灌注30 min 时恢复至阻断前水平，对照组和RG组于再灌注60 min 时恢复至阻断前水平。再灌注期间各时间点，R组OL 均小于对照组和RG组。

表1 SEP 变化

2．3 神经行为学观察 见表2。术前动物神经行为学评分均为0 分。再灌注各时间点3组后肢神经行为学评分均较术前显著增加，但R组明显低于对照组和RG组。

表2 神经行为学评分变化

2．4 血清NSE 质量浓度变化 见表3。

表3 3组血清NSE 质量浓度变化 μg/L

2．5 MOR mRNA 表达变化 见表4。再灌注24 h 时R组脊髓组织MOR mRNA 表达较对照组和RG组明显增加。

2．6 感觉神经元异常率 见表4。再灌注24 h，R组感觉神经元异常率明显低于对照组和RG组。

表4 3组再灌注24 h 脊髓组织中MOR mRNA 表达及感觉神经元异常率的比较

3 讨论

研究［8］发现，MOR 在调节神经、精神、内分泌活动以及呼吸、心血管生理功能活动中具有重要作用。SCIRI 可引起脊髓组织中MOR mRNA 表达显著降低，且MOR mRNA 表达变化与NSE 变化显著相关，提示MOR 表达变化与SCIRI 引起神经元损伤的发生、发展有密切联系，MOR 表达下降不利于缺血脊髓组织血液供应恢复后的神经功能恢复。REMPCL 为MOR 激动剂，极易通过血脊屏障。该研究观察了腹主动脉内局部灌注REM-PCL 对SCIRI 兔SEP 的影响，探讨REM-PCL 的脊髓保护作用。

研究中，预实验结果表明，随着腹主动脉内局部灌注REM-PCL 剂量的增加，实验动物神经功能障碍逐渐减轻，表现为后肢神经功能的恢复及截瘫率的下降，最佳剂量为0．1 mg/kg，故研究中0．1 mg/kg 为REM-PCL 实验剂量。麻醉药物不仅可以影响SCIRI 程度，还可能通过影响呼吸和循环系统引起缺氧，进一步加重脊髓损伤。一些静脉麻醉药物和心血管活性药物对缺血神经元有明显保护或损伤作用，如氯胺酮通过拮抗N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体而产生脊髓保护作用［9］。因此，实验中仅静脉注射30 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉动物并保留自主呼吸，且不应用其他具有心血管活性的药物。实验中腹主动脉阻断和开放期间所有动物均未发生缺氧，血气监测值均无明显变化，术后2 h 内动物完全苏醒，说明研究采用的麻醉方式合适，并且0．1 mg/kg REM-PCL 的灌注剂量对内分泌系统、呼吸系统和心血管系统等均无负性影响，未发生体温降低、呼吸抑制和心律失常等不良反应，可以安全使用。采用阻断腹主动脉方法主要引起L3～L4 脊髓节段损伤，同一节段主要累及前角及后角，与此同时，腹主动脉阻断法建立SCIRI 模型具有经济、手术操作过程简单、重复性好以及缺血再灌注效果确切等特点。

研究［10-13］表明，SEP 作为客观性和敏感性更好的检测方法能够准确地反映脊髓感觉功能受损的程度。SEP 经脊髓后索和后外侧索传导，能够直接、客观地反映脊髓感觉传导束的机能状态［14-16］。SEP IPA 主要与有效传导纤维数目及动作电位大小有关，OL 主要与传导路径中的突触数目、突触延搁时间、神经髓鞘的脱失和受损有关［17-18］。SEP 与运动传导束之间存在一定联系，也可作为评价后肢运动功能的间接指标［19］。血清NSE 水平是一种测定方法简便、特异性和敏感度高的神经元或神经细胞损伤标志。SCIRI 过程中，神经元细胞膜完整性破坏，NSE 由胞内释放至胞外，通过血脊屏障进入循环［20］，提示外周血NSE 水平变化可反映SCIRI 程度及用于SCIRI 预后评估。

该研究结果显示，对照组再灌注24 h 内实验动物的SEP OL 逐渐并持续延长，IPA 于再灌注初期急剧降低，随后逐渐恢复至阻断前水平;与此同时，血清NSE 质量浓度随着再灌注时间的延长而逐渐升高，并于再灌注24 h 时达到最高，说明神经元持续受损。RG组上述指标测值及变化趋势与对照组相似。而再灌注期间R组OL 延长程度小于对照组和RG组，IPA 亦于再灌注30 min 时即恢复至阻断前水平;与此同时，R组血清NSE 质量浓度虽然也升高，但始终明显低于对照组和RG组，并于再灌注60 min 时开始降低，至再灌注24 h 时恢复至阻断前水平;再灌注期间R组神经行为学评分始终低于对照组和RG组;再灌注24 h 时，R组脊髓组织MOR mRNA 表达水平明显高于对照组和RG组，感觉神经元异常率明显低于对照组和RG组。

该研究结果说明，阻断-开放腹主动脉引起SCIRI 后脊髓损伤区域感觉神经纤维功能降低，有效传导纤维数量减少，传导速度下降，且受损伤的神经元兴奋性下降，因此不能形成正常的SEP。REM-PCL对脊髓感觉传导通路产生保护作用，使脊髓缺血期间感觉神经纤维及神经元破坏减少，可使缺血脊髓恢复血液灌注后感觉神经纤维及神经元功能恢复加快，在一定程度上增强了该通路将感觉神经形成的动作电位向大脑皮层传递的能力，该保护作用可能与MOR 的激活有关。

综上所述，经导管腹主动脉内局部灌注REMPCL 预处理缺血脊髓组织可减轻SCIRI 引起的脊髓电生理功能损害，并具有促进损伤感觉神经纤维和神经元的电生理功能恢复的作用。

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