rh-bFGF对缺血再灌注损伤兔视网膜组织中Caspase表达的影响

邵宏超，葛嫣然，刘岩，苏杰

（河北联合大学附属医院，河北 唐山 063000）

缺血性视网膜在恢复血供后，视力未见提升反而进一步下降，这种视功能损伤是不可逆的，临床上称之为视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）［1］。RIRI作为一个很常见的病理生理损伤过程，其损害机制是多方面的［2］，其中凋亡作为细胞死亡的主要形式之一备受关注，而半胱氨酸蛋白酶2（Caspase-2）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）被认为是参与细胞凋亡的两种重要凋亡因子。重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh-bFGF）是利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达、纯化而获得的一种细胞因子，具有诱导新生血管生成、组织损伤修复、保护并刺激神经元再生等作用［3，4］。目前已有实验证实，玻璃体内注射成纤维细胞生长因子溶液，能够对视网膜RIRI组织起到保护作用，但其具体保护机制仍不十分清楚。本研究观察了rh-bFGF对RIRI兔视网膜组织中Caspase表达的影响，进一步讨论rh-bFGF对RIRI发挥保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性体健大耳白兔52只（本院动物中心购入），体质量（2.2 ±0.2）kg，外眼及眼底正常者纳入试验，动物饲养于相同生长环境，且均选取左眼为实验眼。52只大耳白兔随机分为A组（24只）、B组（24只）、C组（4只）。

1.2 主要试剂 rh-bFGF分装试剂购于上海西塘生物科技有限公司，Caspase-2单克隆抗体、Caspase-3单克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 RIRI模型制备及rh-bFGF干预 A、B组均制备RIRI模型。A组实验动物在建立RIRI模型初始时往玻璃体内注射2 μg的rh-bFGF溶液，B组注射同等剂量的生理盐水。RIRI模型的建立采取前房加压灌注法:兔耳缘静脉给予1 g/L的乌拉坦5 mg/kg注射麻醉，同时兔眼眼表滴用0.4%奥布卡因表麻。麻醉满意后固定于操作台上，呈俯卧位，均选取左眼造模，A、B组给予复方托吡卡胺滴眼液滴眼，散瞳后将5号头皮针从兔耳前方角巩膜缘处穿刺入前房，头皮针另一端连接生理盐水输液瓶，缓慢匀速提升输液瓶高度使其产生16.7 kP压力［5］。视网膜中央动脉血供中断标准:球结膜、虹膜颜色变苍白，视网膜明显水肿且呈苍白色。前房灌注维持60 min，之后逐渐降低输液瓶高度至动物眼水平，此时球结膜动脉血流恢复，虹膜颜色恢复正常，视网膜血供恢复橘红色，缺血再灌注模型造模成功［6］。C组散瞳后，仅行前房穿刺操作，不做其他特殊处理。

1.4 视网膜组织病理学变化及 Caspase-2、Caspase-3表达检测 C组动物处死并摘除眼球，A、B 组于制模后 1、6、12、24、48、72 h 分别各处死 4 只动物并摘除眼球，眼球标本制作石蜡切片后用于HE染色及免疫组化染色。视网膜组织病理学变化:烘干切片，脱蜡，乙醇复水，每个浓度2 min。苏木素染色，0.5%盐酸乙醇分化，1%氨水泛蓝，1%伊红染色，之后乙醇脱水，每个浓度2 min，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察兔视网膜各层组织结构变化。Caspase-2、Caspase-3表达:采用SABC免疫组化法。切片常规脱蜡至水，然后加入H2O2灭活内源性酶，再加入山羊血清封闭液。之后顺次加入一抗、生物素化二抗，SABC，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察。每只眼球随机取4张切片，每张切片随机取4个视野，由各视野的阳性细胞数算出平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以±s表示，比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组兔视网膜组织病理学变化 C组兔视网膜层次分明、结构规整，视细胞层、双极细胞层、神经节细胞层（RGC）的细胞核平行排列，RGC呈卵圆形，为单层排列，位于内界膜外侧，无空泡变性;内核层与外核层的细胞有多层细胞核，每一层细胞核之间呈紧密、规则排列，与内、外丛状层分界清楚。B组兔视网膜出现明显水肿，视网膜各层细胞排列疏松，细胞之间空隙增大，同时发现RGC和内核层细胞出现空泡样变性，神经节细胞数目较前减少，内核层细胞数也出现下降，神经纤维层和内丛状层出现肿胀且较正常组织有所增厚，细胞层次排列紊乱伴大量丢失。A组各层组织损害有着与B组相同的变化趋势，但各层视网膜细胞损害程度较B组轻。

2.2 各组制模后不同时点兔视网膜组织中Caspase-2、Caspase-3表达比较 结果见表1。

表1 各组制模后不同时点兔视网膜组织中Caspase-2、Caspase-3 表达比较（±s）

表1 各组制模后不同时点兔视网膜组织中Caspase-2、Caspase-3 表达比较（±s）

注:与B 组比较，*P ＜0.05;与A、B 组比较，＊＊P ＜0.01;与同组1 h比较，△P＜0.05;与同组6 h比较，▲P ＜0.05;与同组 12 h比较，☆P＜0.05;与同组24 h比较，★P ＜0.05;与同组48 h比较，○P＜0.05。

组别 n Caspase-2 Caspase-3 A组4 1 h 0.087 ±0.005 0.086 ±0.019 6 h 0.426 ±0.061＊△ 0.198 ±0.041＊△12 h 0.712 ±0.086＊△▲ 0.895 ±0.076＊△▲24 h 1.398±0.091＊△▲☆ 1.898±0.054＊△▲☆48 h 1.135±0.064＊△▲☆★ 1.631±0.081＊△▲☆★72 h 0.342±0.103＊△☆★○ 0.977±0.093＊△▲★○B组 4 1 h 0.098 ±0.011 0.107 ±0.013 6 h 0.588 ±0.065△ 0.602 ±0.071△12 h 1.327 ±0.062△▲ 1.815 ±0.086△▲24 h 2.897 ±0.102△▲☆ 3.690 ±0.139△▲☆48 h 2.132±0.088△▲☆★ 2.521±0.071△▲☆★72 h 1.022±0.056△▲☆★○ 1.339±0.089△▲☆★○C组 4 0＊＊ 0＊＊

3 讨论

研究发现，RIRI是通过诱导RGC发生的凋亡，从而导致不可逆性损害。视网膜急性缺血性疾病经过治疗后，视网膜细胞在缺血损伤后再次进行再灌注，之后不仅未能挽救视功能反而会加重视功能的损害，引起视网膜损伤，并进一步导致细胞死亡。因此，进一步讨论RIRI的发病机制以及便捷、高效的治疗方法对临床治疗此类疾病非常重要。

近年研究［7］发现RIRI后神经节细胞死亡的主要形式之一是凋亡。Caspases是一种IL-1β转化酶样蛋白酶，同时它也是一个大家族，目前已知其下至少包含14个成员种类［8］。当Caspase家族中的某一个成员激活时，均会引发家族中其他成员的连锁反应，进而将Caspases激活，被激活的Caspase作用于不同底物，各种底物在其作用下最终出现细胞凋亡的过程。因此，Caspases也被人们称为细胞凋亡执 行 者［9，10］。 目 前 认 为，在 Caspase 家 族 中Caspase-2、Caspase-3与细胞凋亡存在最为紧密的联系［11，12］。

Caspase-2最初被命名为Nedd-2/Ich-1，它具有启始Caspases的长结构域。活化的Caspases-2可以通过直接或间接的途径，经过酶切Bid（一种促调亡的bcl-2蛋白）的诱发，最终导致线粒体中凋亡相关蛋白释放，并呈剂量依赖关系。大量研究发现，由Caspases家族成员介导的细胞凋亡是一个繁琐的过程，其中成员之一的Caspases-2又在此复杂过程中发挥至关重要的作用。Caspases-2在Caspases家族中起两种作用:①Caspase-2可激活下游的Caspases，起到传导信号的作用。有实验表明，Caspase-2可正向激活 Caspase-3，而 Caspase-3又可反向激活Caspase-2，这样二者形成一个环状反馈，进而促进Caspases家族的级联反应;②Caspase-2可直接裂解蛋白，导致细胞凋亡。

Caspase-3又称为半胱氨酸蛋白酶32，其基因是1994年 Fernandes-Alnemri等利用 RT-PCR技术从T淋巴细胞文库中筛选出，Nicholson等在凋亡细胞中分离提纯出来的一种蛋白酶。在未发生细胞凋亡时，Caspase-3以无活性的前Caspase-3形式存在，当细胞发生凋亡时则变为有活性的Caspase-3，有活性Caspase-3可进一步使组成细胞的重要蛋白质降解失活。因此，作为细胞凋亡蛋白酶级联反应的重要一环，Caspase-3是目前探讨细胞凋亡的热点。

rh-bFGF是成纤维细胞生长因子家族的一种，它同时拥有多种生物学活性［13］。rh-bFGF可直接刺激成纤维细胞和细胞外基质蛋白质的有效结合，形成胶原纤维;还可与相应受体结合，通过诱导相关内皮细胞迁移，进而促进毛细血管的增生，最终形成胶原纤维［14］;同时可使血管细胞迅速增殖，改善局部微循环和组织的营养状况［15］。本研究显示，A组兔视网膜组织在水肿程度、空泡变形和核固缩方面均较B组有不同程度改善，Caspase-2、Caspase-3也较B组下降。由此我们推论，视网膜RIRI后玻璃体腔内注入 rh-bFGF，可通过下调凋亡基因 Caspase-2、Caspase-3的阳性表达，从而达到减少神经细胞凋亡数量的效果，这可能是rh-bFGF治疗RIRI的作用机制之一。

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