顺铂与紫杉醇联合应用对小鼠宫颈癌组织中Bcl-2、Bax、Caspase-9 表达的影响

黄彤辉

（南华大学附属南华医院，湖南 衡阳 421001）

联合化疗可显著提高单个化疗药物的抗肿瘤效力，同时可明显减轻化疗药物的毒性反应。紫杉烷类与铂类之间存在交互作用，其合并效应呈现出不同程度的相加。目前，顺铂（DDP）和紫杉醇（TXL）联合化疗已成为治疗宫颈癌常用的化疗方案。小剂量DDP和TXL联合化疗方案的抗癌作用与肿瘤细胞凋亡是否有关未见相关报道。以往研究显示，DDP和TXL联合化疗对小鼠宫颈癌细胞有促凋亡作用，但其相关机制鲜有报道。本研究观察了DDP联合TXL化疗对小鼠宫颈癌细胞Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）表达的影响，进一步讨论DDP、TXL联合化疗对小鼠宫颈癌细胞促凋亡作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及实验动物 小鼠宫颈癌U14细胞株。实验用615小鼠32只，雌性13只，雄性19只;18～22 g，4～6周;DDP每支 10 mg、TXL每支30 mg;小鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体及兔 Caspase-9多克隆抗体。

1.2 模型制备及顺铂、紫杉醇干预 每只小鼠右腋窝皮下接种0.1 mL（1×106个宫颈癌U14细胞），接种10 d后，可扪及皮下结节状瘤体。当小鼠皮下结节状瘤体直径约6 mm（100 mm3）且无并发症即可入选注药。小鼠随机分为A组9只、B组9只、C组10只、D组10只。A组小鼠皮下注射生理盐水0.2 mL，每6天1次。B组小鼠皮下注射DDP 4 mg/（kg·mL），每6天1次。C组小鼠腹腔注射TXL 50 mg/（kg·mL），每周1次。D组小鼠皮下注射DDP 4 mg/（kg·mL），每6 天1 次;TXL 50 mg/（kg·mL），每周1次;第1次注射时先注射TXL后注射DDP，其后两药序贯用药。待各组中出现第1只小鼠死亡为治疗终止时间点，处死全部实验用小鼠，切除完整肿瘤组织，用10%中性甲醛溶液浸泡固定，乙醇梯度脱水后石蜡包埋，常规切片（4 μm 厚）。

1.3 宫颈癌组织Bcl-2、Bax、Caspase-9检测 采用免疫组化SP法。用PBS液代替一抗作阴性空白对照。Bcl-2、Bax及Caspase-9一抗工作浓度分别为1∶150、1∶100、1∶100。以 PBS 代替一抗作为空白对照。一抗孵育4℃过夜，镜下控制染色，Bcl-2、Bax及Caspase-9阳性反应均表现为定位于胞膜和胞质内棕黄色或棕褐色细小颗粒。每张免疫组化片随机选取10个高倍视野，使用免疫组化图像分析软件测其积分光密度值并取其平均值，以积分光密度值反映 Bcl-2、Bax、Caspase-9 表达情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组宫颈癌组织Bcl-2、Bax、Caspase-9表达比较见表1。

表1 各组宫颈癌组织Bcl-2、Bax、Caspase-9表达比较（ ± s）

表1 各组宫颈癌组织Bcl-2、Bax、Caspase-9表达比较（ ± s）

注:与 D 组比较，*P ＜0.05。

组别Bcl-2 Bax Bax/Bcl-2 Caspase-9 A 组 6 300.43 ±458.34* 7 244.22±363.72* 1.14 ±0.31* 5 144.22 ±363.71*B 组 4 146.56 ±202.50* 6 613.89±237.49* 1.59 ±0.22* 6 913.89 ±337.49*C 组 5 361.20 ±367.80* 6 210.50±320.25* 1.15 ±0.31* 9 310.50 ±220.25*D 组 1 950.80 ±103.31 9 334.40±471.53 4.79 ±1.34 10334.40 ±351.53

3 讨论

联合、间隙、持续化疗为目前恶性肿瘤主要的抗癌方案。2014年FIGO指南指出，DDP和TXL联合化疗为宫颈癌的常用化疗方案［1］。目前研究认为，TXL通过结合到微管蛋白上，从而促进微管蛋白的聚合。DDP于1978年首先在美国批准于临床应用，为第一代铂类抗肿瘤药物，具有广谱的抗肿瘤作用，迄今为止是被公认为最有效的化疗药物之一，并被推荐用于复发或远处转移宫颈癌患者的一线单药化疗，DDP阻碍DNA合成及复制，从而抑制肿瘤细胞的生长［2］。细胞凋亡是一种或多种刺激因素诱发的程序性破坏过程，是由相关基因介导的细胞生理死亡方式，它对维持机体内外环境的恒定具有重要意义。生理性细胞凋亡对维持正常的生命活动是必需的，而药物诱导的病理性凋亡同样具有重要的临床意义。凋亡诱导产生的Caspase级联反应有两条信号转导途径，即内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径。多数抗肿瘤药物即通过内源性线粒体途径发挥细胞毒性作用，最终导致细胞凋亡。

Bcl-2家族分为Bal-2和Bax两大亚族，Bal-2家族中包括Bax、Bak、Bad、Bid和 Bim，通过形成一个通道启动线粒体通透性转变孔改变膜对一些离子、小分子或蛋白质的通透性而参与细胞凋亡的调控。定位于内质网膜上的Bcl-2为公认的Bcl-2家族蛋白成员中主要抗凋亡分子。Bcl-2通过干扰细胞色素C及Ca2+的释放，降低核酸内切酶活性，导致细胞色素C无法达到激活下游胱冬肽酶的阈值，从而保护细胞器功能，抑制细胞凋亡。而Bax是促凋亡基因，Bax的N端暴露，引起细胞色素C和各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡［3～7］。Bax/Bcl-2的比值决定了细胞是否凋亡。Caspase-9是天门冬氨酸蛋白酶家族中13种Caspase的主要成员之一，是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶，处于凋亡的始动阶段，一旦被激活，即发生下游的级联反应，导致细胞凋亡［8～11］。Caspase-9主要在内源性细胞凋亡途径中活化，从而激活效应Caspase-3导致细胞凋亡。从阳性信号分布来看，Caspase-9主要位于肿瘤细胞质，从阳性表达率来看，Caspase-9在肿瘤细胞中的表达率与正常组织无差异。说明Caspase-9在正常组织中的表达也是一个经常性的事件。但是Caspase-9在抗癌治疗过程中表达量增加可能有助于此肿瘤的治疗，Caspase-9的高表达在促进细胞的凋亡中发挥重要作用［12，13］。本研究显示，与单用 DDP 或 TXL 相比，DDP联合TXL化疗可降低Bcl-2水平，增加Bax、Caspase-9表达及Bax/Bcl-2。

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