双醋瑞因对大白兔肥厚黄韧带作用机制的病理免疫组化研究

吴方云

黄韧带肥厚是脊椎退行性变过程中的一种病理表现，常与椎间盘突出、椎板及小关节增生肥大并存［1］。黄韧带肥厚可达 7～15 mm，多伴有不同程度的钙化和骨化，骨化后的黄韧带与椎板常融合成一整块骨板，使椎板增厚可达30 mm以上。黄韧带肥厚骨化可使椎管矢状径变小，产生椎管狭窄症［2］。黄韧带退变肥厚的过程中有 IL－1、IL－6、TNF－α 和TGF－β1的共同参与，且诱导或促进了退变肥厚。双醋瑞因是一种新的白介素（IL）－1抑制药，主要用于治疗骨性关节炎，有效率在 72.0%～83.3%。 国内研究显示，本品可显著改善骨性关节炎及相关疾病引起的疼痛和关节功能障碍等症状，作为一种治疗骨性关节炎的口服药物，不仅能缓解症状，而且能真正缓解疾病进程，是骨性关节炎治疗上的重大进步。相关研究指出，双醋瑞因应该能对黄韧带的退变肥厚过程起到一定作用［3］。本研究应用双醋瑞因作用于黄韧带退变肥厚过程，从分子生物学角度来阐述作用机制，可以针对黄韧带肥厚造成的椎管狭窄症患者治疗提供一种新的非手术的治疗方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物 本次研究采用的实验动物为新西兰大白兔，雄性，体质量 1.8～2.2 kg，购自济南西岭角养殖繁育中心，动物合格证号为：20100005。造模成功的大白兔共90只，另外45只为正常大白兔。双醋瑞因由山东中医药大学附属医院提供。

1.2 方法 模型建立采用笔者先前的方法［4］，将造模成功动物分为模型组与药物组；模型组以生理盐水灌胃，药物组为双醋瑞因灌胃，剂量为3.8 mg/kg，连续干预3个月。另外选择45只同龄的清洁级新西兰大白兔45只作为正常组，正常组不造模，同药物组一样采用生理盐水灌胃，其余操作同模型组。于第4、8和12周，各组随机处死动物至少15只，取黄韧带，10%中性甲醛液固定。用光学显微镜观察三组免疫组化切片中IL－1、IL－6及TNF－α的表达情况，具体评分标准见表1。

表1 IL－1、IL－6 和 TNF－α 染色结果评分标准

1.3 统计学处理 采用 SPSS20.0版统计软件，率的比较采用的是χ2检验，检验的标准定为α＝0.05。

2 结 果

模型组与药物组中黄韧带细胞质或细胞核中IL－1、IL－6、TNF－α 的表达明显高于正常组，有统计学意义。药物组的 IL－1、IL－6、TNF－α 表达阳性率显著低于模型组，有统计学意义。见表2、3、4。

表2 兔黄韧带组织中的IL－1表达情况比较

表3 兔黄韧带组织中的IL－6表达情况比较表

表4 兔黄韧带组织中的TNF－α表达情况比较表

3 讨 论

黄韧带增厚也称为黄韧带肥厚。在腰痛或腰腿痛患者中，经造影检查或手术治疗中多观察到有黄韧带增厚者。有研究指出，该韧带的弹力纤维的退行性改变所导致的纤维结缔组织增殖是其病理基础，其与脊柱的损伤和骨关节的退行性改变有密切的联系。临床还见到只有该韧带增生，而未见有骨结构改变者。但无论是单独发生或是共同发生，均将导致椎管的矢状径缩小，并因此而导致继发性椎管狭窄症的临床症状［5］。

黄韧带过度增厚，使该处的神经根极易受到压迫，马尾神经即容易受到挤压，因而引起腰痛、下肢疼痛、无力、大小便障碍，出现椎管狭窄及神经根的压迫症状。通常发生在腰4、5椎板之间。黄韧带肥厚造成的椎管狭窄症属于软组织性狭窄，可采用针刀治疗；黄韧带骨化造成的椎管狭窄症则属于骨性狭窄，又能选择手术治疗，可采取手术切除黄韧带，来解除神经根的压迫症状。

双醋瑞因是一种IL－1抑制药，主要是通过抑制IL－1的活性而发挥作用，但不影响前列腺素的合成，是治疗骨关节炎的另一种有效的药物。临床研究表明，双醋瑞因可显著缓解骨关节炎的症状，修正骨关节的结构，属于改变骨关节炎症状和病情的慢作用药物［6］。

双醋瑞因在骨关节炎动物模型也显示了对软骨的短期和长期的明显保护作用，降低了骨关节炎常见的软骨、骨及滑膜损伤的发生率和严重程度，除轻度腹泻外未见其他靶器官的损害［7］。体内外实验也未发现任何生殖毒性、致癌性，对动物的生殖力、围生期毒性和致畸胎研究结果均显示了双醋瑞因的安全性［8］。本品为骨关节炎IL－1的重要抑制药，属小分子蒽醌类大黄属二乙酰衍生物。在动物和人体内，口服本品在进人体循环前经脱乙酰基作用生成活性代谢产物大黄酸。健康成人单次口服给药达峰时间约为2.4 h，血浆蛋白结合率＞99%，血浆半衰期约为4.2 h，本品表观生物利用度为35%～56%。代谢产物大黄酸主要经肾排泄，小部分也经胆汁排泄。

夏光涛［9］认为，骨关节炎（OA）是导致老年人行动障碍的最常见原因之一，临床尚缺乏相关特异性药物治疗方案。OA治疗新药双醋瑞因可改善软骨代谢，有望延缓或逆转OA疾病进程，提高临床OA治疗水平。冯建华［10］为了观察双醋瑞因治疗骨关节炎的临床疗效，选用双醋瑞因组50 mg/d，美洛昔康组15 mg/d，1个月为1个疗程，持续1～3个疗程，随访1～3个月。经1个疗程治疗，有效率分别是 62.22%和68.33%，3个疗程后， 有效率分别是84.44%和71.67%。双醋瑞因组和对照组在主要疗效指标（步行痛、上下楼梯痛）和次要疗效指标（关节压痛）均较治疗前明显改善，但对照组随访期与治疗结束时相比，步行痛、上下楼梯痛和关节压痛程度有所加重。在观察期间，双醋瑞因出现不良反应约为5%，主要为轻度腹泻及腹部轻微疼痛，持续治疗后绝大多数可自行消失，美洛昔康组出现不良反应约为6%，主要为胃肠道反应，如恶心、呕吐等，停用后可消失。由此得出结论，应用双醋瑞因治疗膝骨关节炎疗效肯定，而且双醋瑞因的作用持久，无严重不良反应发生，安全性好。

程坚［11］通过试验探究药物双醋瑞因治疗膝骨关节炎的临床效果及安全。随机选取2010年5月—2012年5月患有膝骨关节炎症状的中老年患者90例，将90例患者随机分为对照组与药物组。药物组患者给予双醋瑞因胶囊治疗，对照组患者给予硫酸氨基葡萄糖胶囊治疗。结果药物组患者在其第14周与第 18 周的治愈率为 93.33%（42/45）与 88.88%（40/45）。对照组患者在其第14周与第18周的治愈率为 82.22%（37/45）与 77.77%（35/45）。 药物组治愈率明显高于对照组。因此，采用双醋瑞因治疗中老年人膝骨关节炎。可以有效地恢复中老年人患者的关节功能，清除患者骨内炎症，使患者的关节炎得到有效治愈。

王霖［12］考察双醋瑞因对破骨细胞生成及骨破坏功能是否具有抑制作用，以及双醋瑞因抑制破骨细胞的作用是否与影响成骨细胞中OPG及RANKL的表达有关。应用Western blotting法、流式细胞术及RT2PCR法在蛋白水平及基因水平观察MC3T32E1细胞中RANKL及OPG的表达。双醋瑞因可在基因及蛋白水平上调MC3T32T1细胞中OPG/RANKL的比例。由此得出了结论，双醋瑞因具有抑制IL21β诱导的破骨细胞性骨破坏的作用，这一作用可能与其抑制MC3T32E1细胞中RANKL表达同时促进OPG表达有关。

综上所述，双醋瑞因对局部组织的炎症因子起到了改善作用，通过双醋瑞因的药物干预，肥厚黄韧带中胶原纤维增生明显受到抑制，从而改善肥厚黄韧带中的组织结构，使之恢复至正常状态或接近正常状态。

［1］蒋玉权.腰椎黄韧带肥厚的生化与力学机制研究进展［J］.临床骨科杂志，2009，12（4）：454－456.

［2］陈国阳，陈永旺，张清平，等.双醋瑞因胶囊治疗膝骨关节炎临床观察［J］.吉林医学，2013，34（l2）：2264－2265.

［3］ Altinkaya N，Yildirim T，Demir S，et al.Factors associated with the thickness of the ligamentum flavum：is ligamentum flavum thickening due to hypertrophyor buckling？ ［J］.Spine（Phila Pa 1976），2011，36（16）：1093－1097.

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［5］ Cui G，Watanabe K，Miyauchi Y，et al.Matrix metalloproteinase 13 in the ligamentum flavum from lumbar spinal canal stenosis patients with and without diabetes mellitus［J］.J Orthop Sci，2011，16（6）：785－790.

［6］ 宁金沛.黄韧带肥厚机制研究进展［J］.医学综述，2012，18（6）：896－897.

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［8］ Chen YT，Wei JD，Wang JP，et al.Isolation of mesenchymal stem cells from human ligamentum flavum：Implicating etiology of ligamentum flavum hypertrophy［J］.Spine（Phila Pa 1976），2011，36（18）：1193－1200.

［9］夏光涛，户中丹，李 璐，等.双醋瑞因治疗骨关节炎的临床研究进展［J］.世界临床药物，2010，31（8）：460－463.

［10］冯建华.双醋瑞因治疗骨关节炎的90例临床观察［J］.医学信息，2011，10（9）：4384.

［11］程 坚.双醋瑞因治疗膝骨关节炎的疗效及安全性分析［J］.海峡药学，2012，24（10）：205－207.

［12］王 霖，毛昱嘉，王文杰.双醋瑞因对破骨细胞性骨破坏的抑制作用及机制［J］.药学学报，2006，41（6）：555－560.