P27RF－Rho基因沉默对肝癌Bel7402细胞增殖的影响

邢光远，谢淑丽，邱 伟，王广义，吕国悦，郝恩源，李丁洋

（吉林大学第一医院肝胆胰外科，吉林 长春 130021）

P27RF－Rho（p27kip1releasing factor from Rho A）是新近发现的调控肿瘤细胞中Rho GTPases（RhoA和RhoC）活性的分子，其由161个氨基酸组成，在N端有共同的NH2－MGCCY结构。在多种侵袭性肿瘤中呈高表达状态，主要分布在与基质接触部位细胞膜的内表面［1］。Hoshino等［2］通过大量实验证实：P27RFRho通过与P27kip1结合，解除P27kip1对RHO蛋白的抑制，从而活化RHO蛋白。P27kip1和RHO蛋白与肝脏肿瘤的增殖能力有密切关联［2－3］。但P27RF－Rho在肝癌的发生发展过程中的作用及机制还缺少深入的实验研究。本实验通过靶向沉默P27RF－Rho基因，观察其对肝癌细胞增殖能力影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人肝癌细胞株Bel7402和293T细胞由吉林大学第一医院肝胆胰外科实验室保 存，U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro－P27RF－Rho基因沉默病毒真核表达载体 U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro－Scramble及基因沉默病毒真核表达阴性对照载体自行构建，E.coli DH5α感受态细胞购自美国Invetrogen公司。限制性内切酶、DNA连接酶（thermo）、DNA回收试剂盒及质粒提取试剂盒（中国美基生物公司），RT－PCR试剂盒及DNA Marker DL2000（日本Takara公司）。

1.2 RNAi慢病毒载体的构建和提取 shRNA引物退火形成带黏性末端的双链片段，shRNA序列见表1。反应体系：shRNA－F（100pmol）2μL、shRNA－R（100pmol）2μL、10× 退火缓冲液2μL、ddH2O 14μL，共20μL。反应条件：95℃、5min，72℃、10min，放室温60min。取5μL加水95μL制备退火产物溶液。

表1 shRNA分析的引物序列Tab.1 Sequences of primers for shRNA analysis

表达载体的制备：10×buffer 6μL、慢病毒干扰载体10μL、KpnⅠ 1μL、HpaⅠ 1μL、ddH2O 42μL，共60μL。于37℃酶切3h。干扰片段连接入表达载体：退火产物3μL、载体片段3μL、T4连接酶1μL、10×T4Buffer 2μL、ddH2O 11μL，配成20μL体系，16℃连接过夜，构建成U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro 载体。感受态细胞的转化：从－80℃冰箱取出1管100μL E.coli DH5α感受态细胞，冰上解冻后取10μL重组产物加到感受态中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，再放冰上静置2min。加预先复温的SOC溶液500μL，放摇床摇1h，涂板过夜37℃培养。挑取数个菌落提取质粒测序验证，测序引物 LKO5：5′－GACTATCATATGCTTACCGT－3′。

质粒的提取：吸取菌液培养基于1.5μL离心管中，12000r·min－1离心1min，弃上清，吸取培养基重复离心，弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于－20℃，加Buffer S1悬浮细菌250μL，悬浮均匀，加Buffer S2250μL温和充分地上下翻转6次混合均匀，使菌体裂解。加Buffer S3350μL温和上下翻转，12000r·min－1离心10min。取上清液转移到专用的制备管（2mL），12000r·min－1离心1min，弃滤液。加500μL Buffer W1，12000r·min－1离心1min，弃滤液。加Buffer W2500μL，12000r·min－1离心1min，弃滤液，重复1次。将制备管置回2mL离心管，12000r·min－1离心1min。将制备管移入新的1.5mL离心管中，加60～80μL Eluent或离子水，室温1min，12000r·min－1离心1min。移去制备管，将有质粒的离心管于4℃或－20℃保存。

1.3 病毒包装和P27RF－Rho基因沉默效果的检测质粒DNA与psPAX2和pMD2G质粒共转染293T细胞病毒包装。第1天：转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2×107细胞／20mL，重新接种于15cm细胞培养皿，于37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时转染。第2天：500μL无血清培养基稀释2μg表达质粒＋1.5μg psPAX2＋1.5μg pMD2G；500μL无血清培养基稀释15μL脂质体2000；5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min。从6孔板中吸出1mL无血清培养基，然后滴加入1mL质粒和脂质体混合物。6～10h后，移除含有DNA－脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED＋10%FBS（从此刻开始计算时间）。第3天：转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上。第4天：转染后48和72h分别收获含病毒的上清，3000r·min－1离心20min，0.45nm 滤膜过滤，去除细胞沉淀。12000r·min－1离心浓缩细胞、分装，－80°C贮存；滴度测定。

本实验分为空白对照Bel7402组、阴性对照Scramble－siRNA组（感染U6－shRNA－CMV－copGFP－PGK－Puro－Scramble）和P27RF－RhosiRNA组（感染 U6－shRNA－CMV－copGFP－PGKPuro－P27RF－Rho），48h 荧光显微镜及RT－PCR法检测P27RF－Rho基因沉默效果。P27RF－Rho：F，5′－TGTGACCGGAAGGGCTCCT－3′；R，5′－GAGGAGAAGAGCTGTCCAAG－3′，长 度 为580bp。反应条件：94℃、5min，94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，35 个循环；72℃、10min。

1.4 MTT比色法检测细胞生长曲线 细胞感染24h后各组细胞按0.5×104个／孔密度接种于96孔板，每组接种3孔。共铺6块板，置孵育箱中培养。自接种24h后起，每天随机取1块板，进行MTT比色实验，在酶标仪上波长570nm处测定吸光度（A）值，取平均值，连续6d，绘制生长曲线。以A值表示细胞生长速度，A值越大，细胞生长速度越快。

1.5 细胞平板克隆形成实验 取对数生长期的各组细胞悬液，进行梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100和200个细胞的梯度密度分别接种含10mL、37℃预温培养液的皿中，置37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15min。加适量GIMSA应用染色液染色30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置在显微镜计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率＝克隆数／接种细胞数×100%。

1.6 半定量RT－PCR法检测细胞增殖、侵袭和迁移相关基因表达 提取各组总RNA，半定量RTPCR法检测P16、CyclinE、基质金属蛋白酶9（MMP－9）、周期素依赖性激酶5（CDK－5）的表达。以α－tublin为内参照。α－tublin、P16、CyclinE、MMP－9、CDK－5的引物序列见表2。反应条件：α－tublin，94℃、30s，57℃、30s，72℃、60s，25个循环；P16，94℃、30s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；CyclinE，94℃、30s，62℃、30s，72℃、1min，35个循环；CDK－5，94℃、30s，58℃、30s，72℃、1min，35个循环；MMP－9，94℃、30s，63℃、30s，72℃、1min，35个循环。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下拍照并进行灰度值扫描，对各组mRNA相对内参照水平变化进行比较，mRNA相对表达水平＝目的基因灰度值／内参照灰度值。

表2 α－tublin、P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5基因的引物序列Tab.2 Primer sequences ofα－tublin，P16，CyclinE，MMP－9 and CDK－5genes

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组Bel7402细胞中P27RF－Rho、P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5相对表达水平以表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 细胞转染效果观察 慢病毒感染细胞72h后荧光显微镜下观察结果显示：阴性对照ScramblesiRNA组和P27RF－Rho－siRNA组Bel7402细胞均出现绿色荧光蛋白表达，病毒感染效果良好。见图1（插页六）。

2.2 RT－PCR法检测 P27RF－Rho mRNA 表达P27RF－Rho－siRNA组Bel7402细胞中 P27RF－Rho mRNA表达水平（0.21±0.10）较空白对照Bel7402组（0.90±0.23）和阴性对照 ScramblesiRNA组（0.86±0.18）明显降低（P＜0.01），各组内参照基因α－tublin表达良好。见图2。

图2 RNAi质粒沉默Bel7402细胞中P27RF－Rho mRNA表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of P27RF－Rho mRNA in Bel7402cells silenced by RNAi plasmid

2.3 各组Bel7402细胞生长曲线 各组细胞在培养3d时生长速度无明显差异，从第4天开始，P27RF－Rho－siRNA组细胞生长速度明显低于空白对照Bel7402组和阴性对照Scramble－siRNA组（P＜0.05）。见图3。

2.4 各组细胞平板克隆形成率 空白对照Bel7402组和阴性对照Scramble－siRNA组细胞的克隆形成率分别为（50.12±3.14）%和（48.87±5.69）%，P27RF－Rho－siRNA组Bel7402细胞克隆形成率为（15.14±0.78）%，P27RF－Rho－siRNA组Bel7402细胞克隆形成率明显低于空白对照Bel7402组和阴性对照组（P＜0.01）。见图4（插页六）。

图3 各组Bel7402细胞生长曲线Fig.3 Growth curves of Bel7402cells in various groups

2.5 各组Bel7402细胞中P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA 表达水平P27RF－Rho－siRNA组P16mRNA表达水平高于空白对照Bel7402组和阴性对照组（P＜0.01），而空白对照Bel7402组与阴性对照组比较P16mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；P27RF－Rho－siRNA组CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA表达水平低于空白对照Bel7402组和阴性对照Scramble－siRNA组（P＜0.01），而空白对照Bel7402组与阴性对照Scramble－siRNA组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3和图5。

表3 各组Bel7402细胞中P16、MMP－9、CDK－5和CyclinE mRNA表达水平Tab.3 Expression levels of P16，MMP－9，CDK－5，and CyclinE mRNA in Bel7402cells in various groups（n＝3，）

表3 各组Bel7402细胞中P16、MMP－9、CDK－5和CyclinE mRNA表达水平Tab.3 Expression levels of P16，MMP－9，CDK－5，and CyclinE mRNA in Bel7402cells in various groups（n＝3，）

＊P＜0.01compared with Bel7402group；△P＜0.01compared with Scramble－siRNA group.

Group P16 MMP－9 CDK－5 Cy 0.13 Scramble－siRNA 0.18±0.22 0.79±0.17 0.88±0.19 0.81±0.16 P27RF－Rho－siRNA 0.65±0.11＊△ 0.32±0.11＊△ 0.35±0.14＊△ 0.22±0.12＊clinE Bel7402 0.21±0.14 0.83±0.15 0.91±0.21 0.78±△

3 讨 论

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，在我国其死亡率已位于恶性肿瘤的第2位。抑癌基因的低表达与癌基因的高表达是患者病情进展的重要原因［4］。

图5 RT－PCR法检测各组Bel7402细胞中P16、CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA表达电泳图Fig.5 Electrophoregram of expressions of P16，CyclinE，MMP－9，and CDK－5mRNA in Bel7402cells in various groups detected by RT－PCR method

Rho A和Rho C分子在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的增殖能力有密切关联。其中Rho A促进生长作用较Rho C明显，而Rho C有更强大的促进肿瘤转移作用［5－6］。Rho A和Rho C分子在细胞内受到多种途径的调控，鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）是其中最重要的调控途径，控制Rho蛋白的三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）交换，使Rho A或Rho C在与二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）的失活状态与GTP的活化状态之间循环。鸟嘌呤核苷酸交换因子催化GDP转化为GTP，从而活化Rho A或Rho C。P27kip1在被AKT磷酸化后部分由细胞核转移至细胞浆中，通过与GDP－Rho结合，抑制Rho A和Rho C分子的活性［2］。实验［1］证实：过表达P27kip1的细胞中，Rho A或Rho C的表达减少，且活性降低；P27RF－Rho通过与P27kip1结合，解除P27kip1对Rho蛋白的抑制，增加了GDP－Rho蛋白对鸟嘌呤核苷酸交换因子的敏感度，从而活化Rho蛋白。Hoshino等［2］发现：侵袭性高的鼠黑色素瘤细胞中的P27RF－Rho和与GTP结合的Rho A表达水平较无侵袭性的黑色素瘤细胞和正常组织中要明显增高，且过表达P27RF－Rho后，Rho A的表达较正常对照组增加了50%，而基因沉默P27RF－Rho后，Rho A的表达较正常对照组降低了40%。此外，还有研究［7］表明：P27RF－Rho通过MAPK、mTORC1信号通路及依赖P53分子的细胞凋亡影响肿瘤细胞的增殖能力。

CDK是细胞周期调控网络的核心蛋白，其表达活性的改变直接影响到细胞周期的长短，决定着细胞的进程，与集体细胞的生长、分化、运动、凋亡以及肿瘤的发生发展、转移关系密切［8］。CDK－5是CDK家族中的一员，主要是通过引起细胞增殖和凋亡异常引起肿瘤的发生发展的。研究［9］表明：CDK－5在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中高表达。P16是近年发现的一种抑癌基因，正常情况下其通过阻止细胞由G1期进入S期（DNA合成期），使细胞增殖受阻［10］。P16蛋白表达减少可引起细胞周期失控而诱发癌变。实验［11］表明：肝癌组织中P16呈低表达。肿瘤浸润是肿瘤组织与细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）相互作用的过程，包括黏附、降解及移动3个步骤，实现这一过程首先必须具备降解基底膜及细胞外基质的能力。MMPs是一类能分解细胞外基质与基底膜的蛋白水解酶，MMP－9能降解明胶、层黏连蛋白和巢蛋白，与肿瘤的增殖和发展有密切关系［12］。研究［13］表明：MMP－9在肝癌、胃癌、食管癌、子宫内膜癌、乳腺癌和骨肉瘤等恶性组织中呈高表达特性。CyclinE是重要的细胞周期调节因子，CyclinE基因的低表达可使细胞阻滞在G1期，使G1细胞数目增多，S期细胞减少，进而抑制细胞恶性增殖、恶性转化和肿瘤的发展［14］。CyclinE基因在低分化及肝内转移的肝癌组织中呈过度表达，在正常肝组织中无过度表达［15－19］。

本实验通过靶向沉默P27RF－Rho基因使肝癌细胞的增殖能力明显下降，RT－PCR检测结果显示：P16mRNA表达水平明显升高，CyclinE、MMP－9和CDK－5mRNA表达水平降低。

综上所述，靶向沉默P27RF－Rho基因可以明显抑制肝癌细胞的增殖能力，其机制仍需进一步研究，P27RF－Rho基因将可能成为一个极有前途的肝癌肿瘤生物治疗的新靶点。

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