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不同理化因素对重组人成纤维细胞生长因子21蛋白纯度的影响

2015-11-29王长文王会岩

吉林大学学报(医学版) 2015年3期
关键词:原液冻融纤维细胞

王长文,刘 敏,刘 磊,姜 勇,张 磊,李 艳,王会岩

(1.吉林医药学院公共卫生学院营养与食品卫生学教研室,吉林 吉林 132013;2.吉林医药学院检验学院生物技术教研室,吉林 吉林 132013)

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)是最新被发现的一个成纤维细胞生长因子家族的成员,属于成纤维细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19) 亚族[1-3]。FGF21作为FGF家族的新成员,其具有调控多种内分泌功能[4]。研究[5-6]显示:FGF21的功能主要表现在糖脂代谢的调节上,其可以不依赖于胰岛素而使血糖降低,同时可以调节脂质代谢,缓解脂肪肝动脉粥样硬化。近年来在国际上FGF21已成为糖尿病、脂肪肝、肥胖症和代谢综合征等代谢疾病研究的热点药物,未来有可能替代胰岛素成为治疗糖尿病的新药[7-8]。最新研究[9]表明:FGF21能够保护心肌细胞免受氧化应激带来的损伤。美国Lilly公司已开展FGF21的Ⅱ期临床观察[10]。但对重组人FGF21(rhFGF21)的稳定性研究目前未见报道。本实验利用已构建的高表达FGF21蛋白基因工程菌株,经发酵纯化后,获得纯度大于95%的蛋白[11-12],对其稳定性做进一步观察和测定,以便为制定rhFGF21的质量标准提供依据,也可为其他蛋白质类药物的开发和生产提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 三氟乙酸和乙腈均为色谱纯;其他试剂均为分析纯;rhFGF21原液由吉林医药学院王会岩博士提供,纯度>99%。高效液相色谱仪(E2695,紫外检测器,美国 Waters公司)。

1.2 不同温度时rhFGF21纯度检测 将一定数量的样品放置于25℃、4℃和-20℃下保存,对4℃和25℃样品每周取样品若干支进行外观形状观察和HPLC法检测rhFGF21纯度,-20℃样品保存12个月,每6个月取样品3支进行检测,同时观察外观性状。

1.3 不同缓冲体系和pH值时rhFGF21纯度检测缓冲体系终浓度为20mmol·L-1,蛋白水平为0.5g·L-1,醋酸-醋酸钠缓冲液pH 4.0和pH 5.0、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH 5.0和pH 6.0、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0及Tris-HCl缓冲液pH 7.5和pH 8.0,分别于每7d取3支样品观察rhFGF21原液的外观性状变化并对其纯度进行测定。

1.4 反复冻融处理后rhFGF21纯度检测 将一定数量rhFGF21原液于-20°C冻存,每日固定时间将其融化,然后置于-20°C冻存,如此重复持续12d,每3d观察rhFGF21原液外观性状的变化并对其纯度进行测定。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。rhFGF21纯度检测结果以表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 色谱条件 色谱柱为C18柱(250×4.6mm,5μm);流动相:A 相为0.1%三氟乙酸-注射用水;B相 为A甲醇,C和D相均为水;流速0.5mL·min-1;检测波长280nm;平衡用100%A泵液体至基线稳定,洗脱采用不同浓度梯度A泵逐级洗脱,进样量 10μL。rhFGF21原液HPLC色谱图见图1。

2.2 不同温度时rhFGF21的纯度 25℃时,存放14d时rhFGF21纯度(15.20%±0.14%)较0d时(100.00%±0.00%)下降,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。4℃ 时,存放35d时rhFGF21纯度下降至(89.30±0.39)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。-20℃时,存放6个月时rhFGF21纯度下降至(99.10±0.39)%,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);存放12个月时rhFGF21纯度下降至(95.30±0.39)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 rhFGF21原液HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of rhFGF21original fluid

2.3 不同缓冲体系和pH值时rhFGF21纯度25℃条件下rhFGF21在不同pH值的缓冲体系中保存7d后,pH 4.0和pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液出现浑浊,rhFGF21纯度分别下降至(30.60±0.12)%和(45.60± 0.30)%;pH 5.0和pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液出现浑浊,纯度降至(55.90±0.90)%和(65.90±0.82)%;pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液中,pH 6.0缓冲液浑浊,纯度为(71.10±0.65)%,pH 6.5和pH 7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液澄清透明,纯度为(75.10±0.45)%和(80.50± 0.02)% ;pH 7.5和pH 8.0Tris-HCl缓冲液中,pH 7.5缓冲液澄清透明,纯度为(81.50±0.22)%和(78.40±0.37)%。以上不同pH 值的缓冲液保存后,与对照组(100.00%±0.00%)比较,rhFGF21纯度差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4 反复冻融后rhFGF21的纯度 rhFGF21原液反复冻融后,肉眼观察的结果和纯度检测一样,0~3d瓶内液体仍澄清,无不溶物出现,反复冻融3d后,rhFGF21纯度 [(90.80±0.01)%]与对照组[0d,(100.00±0.00)%]比较差异无统计学意义(P>0.05);6~12d时,发现肉眼可见的不溶物;反复冻融6、9和12d后rhFGF21纯度分别为(90.80±0.01)%、(82.5±0.02)%和(70.6±0.02)%,与对照组(0d)比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

随着基因工程技术的发展,在临床治疗上蛋白质药物已得到大量应用,然而由于蛋白质稳定性不好,易失去活性,限制了部分蛋白质药物的应用。众所周知,蛋白质在水溶液中稳定性较差,这是由于蛋白质在水溶液中容易发生物理或化学方面的某些变化。某些物理因素如温度、离子强度、涡流、表面吸附和化学降解及修饰作用等均会增加疏水表面积从而影响蛋白质的聚合行为,导致蛋白质的活性降低甚至消失、溶解性的降低和免疫原性的改变[13]。最新研究[14-15]表明:聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰、pH值敏感型聚合物水凝胶等均可提高蛋白质的稳定性。

虽然温度是影响蛋白质和多肽稳定性最重要的因素,但其影响机理尚未明确。通常认为:温度越高,蛋白质的稳定性越差。本研究中rhFGF21在水溶液中随着温度的升高稳定性下降,可能是由于高温使其化学降解过程加速。由于蛋白质在胞内处于中性环境中,非常稳定。但当纯化后在水溶液中稳定性较差。本研究结果显示:rhFGF21的稳定性在pH 6.5~8.0溶液中优于酸性或碱性溶液,而且表现出酸性越强其稳定性越差的趋势,极端的pH值会降低盐桥的形成能力,从而导致其稳定性上的降低。

一些蛋白质对溶液的反复冻融很敏感[16]。本研究中rhFGF21对冻融非常敏感,在以后的生产中要尽量避免反复冻融。

综上所述,rhFGF21于低温和pH 6.5~8.0接近中性条件下呈现出较好的稳定性。而高温、偏酸性和偏碱性条件对rhFGF21的稳定性不利。磷酸盐缓冲液对rhFGF21稳定性呈现出较好的作用。反复冻融处理对rhFGF21稳定性具有明显的影响。本实验结果将为rhFGF21纯化工艺的研究、rhFGF21质量标准制定和蛋白质药物制剂开发提供依据。

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