ApoA5 IVS3+476G＞A基因多态性与ApoA5水平及脑梗死的关系

张 桥，谢月萍，张春丽，周碧燕，施 勇，赵 阳

（南宁市第一人民医院，1．老年病科；2．检验科，广西 南宁 530022）

ApoA5 IVS3+476G＞A基因多态性与ApoA5水平及脑梗死的关系

张 桥1，谢月萍1，张春丽1，周碧燕2，施 勇1，赵 阳1

（南宁市第一人民医院，1．老年病科；2．检验科，广西 南宁 530022）

目的 探讨载脂蛋白A5（ApoA5）IVS3+476G＞A基因多态性与血清ApoA5水平及脑梗死的关系。方法 采用酶联免疫吸附试验对急性脑梗死患者135例及对照组患者130例的血清ApoA5浓度进行检测，并通过聚合酶联反应-限制性长度多态性方法对ApoA5 IVS3+476G＞A基因多态性进行检测。结果 脑梗死组的血甘油三酯（TG）水平高于对照组，而ApoA5水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；脑梗死组中的GA/AA基因型频率及A等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；GA/AA基因型的ApoA5水平低于GG基因型，而TG水平高于GG基因型，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 ApoA5 IVS3+476G＞A位点影响ApoA5及TG水平，并且增加脑梗死发病的风险。

脑梗死；ApoA5；IVS3+476G＞A基因多态性；甘油三酯

缺血性脑卒中是脑血管病最常见的类型，约占全部脑血管病的80%。最近的研究显示，脑卒中是导致中国城乡居民死亡的第一位原因[1]，而动脉粥样硬化在缺血性脑卒中的发生发展过程中扮演重要角色。TG升高是动脉粥样硬化的独立危险因素，而ApoA5基因是一种有力的TG调节子。大量研究表明，ApoA5基因与TG表达成负相关[2]。ApoA5基因在国内外已有研究，主要集中在与血脂代谢、动脉粥样硬化及冠心病方面，其基因研究位点主要是-1131T＞C、C56G，亦有少量文献报道ApoA5基因变异与脑梗死关系[3-4]，而IVS3+476G＞A位点与脑梗死的关系尚未见有文献报道。在本研究中，我们以急性脑梗死患者135例作为研究对象，检测ApoA5 水平以及其基因ApoA5 IVS3+476G＞A位点的多态性，分析ApoA5 IVS3+476G＞A基因多态性与脑梗死的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我科2010年1月～2014年12月收治的患者135例为脑梗死组，全部患者均符合1995年全国第四次脑血管学术会议修订的诊断标准[5]（包括病史、体检及头颅影像学CT或MRI检查确诊）。其中男95例，女40例，平均年龄（57.8±12.2）岁；对照组为随机选取同期收住我科的非脑梗死患者130例，其中男90例，女40例，平均年龄（56.3±13.1）岁。两组患者均为汉族，年龄、性别、体质量指数、吸烟、喝酒、教育水平、高血压、冠心病、糖尿病、等临床特征比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。排除合并有脑出血、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤、脑血管畸形、感染、肝肾功能损害、血液系统疾病患者。

1.2 研究方法

标本采集及检测：所有患者于入院后第二天清晨空腹抽取静脉血两管，每管3 mL，其中一管不抗凝，待血液凝固后，以3000 r/min离心10 min，分离血清。总胆固醇（TC）和TG的检测采用双试剂酶法，标准酶试剂盒购自英国RANDOX 公司；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）应用酶联免疫一步法测定，试剂盒由日本第一化学药品株式会社提供；Apo A5 采用免疫透射比浊法，试剂盒购自英国RANDOX 公司。全部测定工作在我院检验科进行，使用日立7170全自动生化分析仪检测。另一管用EDTA抗凝，采用低渗法裂解红细胞后离心提取白细胞，使用DNA提取试剂盒提取DNA（由ABI公司提供）。

引物设计与PCR：根据APOA5基因的IVS3+476G＞A位点的核苷酸碱基序列设计引物，正义链：5’-CTC AAG GCT GTC TTC AG-3’，反义链：5’-CCT TTG ATT CTG GGG ACTG G-3’（上海生工生物工程有限公司合成）。PCR反应体系：总反应体系10 µL中含有模板基因组1.0 µL，2.5×buffer（含Mg2+）4.0 µL，4×dNTP 4.7 µL，taq酶0.1 µL，引物各0.2 µL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s共35个循环；72℃延伸10 min。取PCR产物约10 µL，2%琼脂糖凝胶电泳，结果为一条大小约280 bp的目标条带。

基因型分析：取PCR产物5 µL进行酶切，内切酶Fau I（由NEB公司提供）。酶切总反应15 µL反应体系，其中包括：PCR产物5 µL，10×NEB缓冲液1.5 µL，内切酶0.8 µL。反应条件：55℃温育3 h，2%琼脂糖凝胶电泳。酶切结果：纯合子GG型为141 bp、114 bp、25 bp大小的三个条带；杂合子GA型为141 bp、73 bp、41 bp、25 bp大小的四个条带；纯合子AA型为73 bp、41 bp大小的两条带。为进一步验证PCR结果，将PCR产物及酶切产物送中山大学达安基因股份有限公司进行基因测序。

1.3 统计学方法

所收集资料使用Excel建立数据库，采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计量资料以“±s”表示，采用t检验。计数资料采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者血脂和ApoA5水平比较

脑梗死组的TG水平高于对照组（P＜0.05），ApoA5水平低于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者血脂和ApoA5水平比较（±s）

表1 两组患者血脂和ApoA5水平比较（±s）

项目 脑梗死组（n=135）对照组（n=130） t P TG（mmol/L） 2.74 ±1.12 2.10±1.03 4.8368 0.0000 TC（mmol/L） 5.75±1.05 5.63±1.02 0.9432 0.3465 LDL-C（mmol/L） 3.37±0.96 3.29±1.03 0.6543 0.5135 HDL-C（mmol/L） 1.26±0.37 1.33±0.42 1.4410 0.1508 Apo A5 3.73±1.13 4.31±1.07 4.2871 0.0000

2.2 基因突变频率比较

脑梗死组的APOA5基因IVS3+476G＞A位点的GA/AA基因型频率及A等位基因频率高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组患者APOA5基因 IVS3+476G＞A位点基因频率分布差异 [n（%）]

2.3 不同ApoA基因 IVS3+476G＞A位点之间血脂水平比较

GA/AA基因型的ApoA5水平低于GG基因型（P＜0.05），而TG水平明显高于GG基因型（P＜0.05）。见表3。

表3 APOA5基因IVS3+476G＞A位点患者之间血脂及ApoA5水平比较（±s）

表3 APOA5基因IVS3+476G＞A位点患者之间血脂及ApoA5水平比较（±s）

项目 TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）HDL（mmol/L） ApoA5 GG 5.35±0.95 2.23±1.1 3.36±0.97 1.35±0.454.36±1.09 GA/AA 5.28±1.03 2.72±1.07 3.38±1.041.28±0.383.62±1.18 t 0.5754 3.6739 0.1620 1.3656 5.3056 P 0.5655 0.0003 0.8715 0.1732 0.0000

3 讨 论

ApoA5基因位于人类的染色体11 q23，长约2.5 kb，与载脂蛋白A1/C3/A4基因簇紧密相连，组成一个基因家族。ApoA5由肝脏特异性表达，分泌于血浆后存在于高密度脂蛋白（HDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）及乳糜颗粒中，生理情况下血液中ApoA5浓度极低，仅有（114～258）µg/L。ApoA5主要影响血浆TG代谢并呈负相关。Pennacchio等[6]的实验表明，表达ApoA5基因的小鼠血浆TG浓度比ApoA5基因敲除小鼠降低65%，而敲除ApoA5基因的小鼠的血清TG水平比野生型小鼠升高4倍，但这两种小鼠模型的TC和HDL的浓度均无明显变化；敲除纯合子基因的小鼠的VLDL水平升高，相反，转染ApoA5基因的小鼠VLDL水平下降；而敲除杂合子基因的小鼠的VLDL水平介于纯合子基因敲除小鼠和野生型小鼠之间，以上这些结果均表明ApoA5基因对TG有负性调节作用。本研究发现急性脑梗死患者ApoA5和HDL水平明显低于对照组，而TC、TG、LDL明显高于对照组，提示血脂异常与脑梗死发病密切相关。然而，其机制尚未明确，目前较多的观点认为ApoA5可能通过以下三种途径影响TG代谢：①激活TG代谢中的关键酶-脂蛋白脂酶（LPL），从而促进TG的分解。在细胞外途径中，ApoA5可通过影响脂蛋白LPL促进血TG的清除。ApoA5作为LPL异构激活剂，可通过变构效应而促进LPL与血管内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白（HSPG）结合，增加含TG丰富的脂蛋白与HSPG-LPL复合物相互接触的机会，有利于LPL对富含TG的脂蛋白，如VLDL和乳糜微粒（CM）的水解作用，从而使TG水平降低；而缺乏LPL的过表达ApoA5基因的小鼠的TG水平无明显变化，提示ApoA5激活LPL调节TG的代谢。而Huang等的研究[8]进一步证实了ApoA5通过稳定LPL二聚体而增加其脂解活性。②阻碍肝脏中VLDL的装配，抑制其合成和分泌。Shu等[9]认为ApoA5可作为肝细胞输出脂类的控制开关，有延缓VLDL装配和进入分泌途径的作用。③增强VLDL与低密度脂蛋白（LDL）受体的亲和力，从而促进肝脏摄取脂质颗粒。因此，ApoA5水平降低可导致血管内皮脂质积累及动脉粥样斑块形成，并最终增加缺血性脑卒中发生的风险。

多项研究表明，ApoA5基因多态性与TG升高、冠心病、脑梗死及代谢性疾病有一定的关联性且存在种族及地域差异[10-12]。Maasz等[13]的研究发现，ApoA5 IVS3+476G＞A基因型是所有缺血性卒中的危险因素，其机制主要是通过提高TG水平，加速动脉粥样硬化进程，从而增加缺血性脑卒中的发生风险。目前国内尚无研究报道ApoA5基因 IVS3+476G＞A位点与脑梗死的关系，中国汉族人群的缺血性脑卒中患者的是否也与与ApoA5基因 IVS3+476G＞A位点变异有关尚未明确。为此，我们通过对135例脑梗死和130例非脑梗死的汉族患者进行研究，结果表明脑梗死组中的APOA5基因 IVS3+476G＞A位点的GA/AA基因型频率及A等位基因频率显著高于对照组 （P＜0.05）；GA/AA基因型的ApoA5水平明显低于GG基因型（P＜0.05），而GG/AA基因型的TG水平明显高于GG基因型（P＜0.05）。与国外关于白种人的IVS3+476G＞A位点突变作为脑梗死危险因素的研究结果相似。但由于例数较少，尚不能准确的反映APOA5基因IVS3+476G＞A位点是否在我国汉族人群中存在突变，更无法进一步研究此位点突变是否与脑梗死的发生有关，有待进一步的大样本研究。

综上所述，本研究发现脑梗死患者中ApoA5水平降低，而ApoA5水平降低可能在脑梗死的发生发展中扮演重要角色。ApoA5基因IVS3+476G＞A位点影响ApoA5及TG水平，并且增加脑梗死发病风险。

[1] Feigin VL,Wang W,Fu H, et al. Primary stroke prevention in China - a new approach [J]. Neurol Res,2014,37(5):378-380.

[2] Li S, Hu B, Wang Y, et al. Influences of APOA5 variants on plasma triglyceride levels in Uyghur population [J]. PLoS One,2014,9(10):258.

[3] Can Demirdöğen B, Sahin E, Turkanoglu Ozcelik A, et al. Apolipoprotein A5 polymorphisms in Turkish population: association with serum lipid profile and risk of ischemic stroke [J].Mol Biol Rep,2012,39(12):459-468.

[4] Pi Y,Zhang L,Yang Q, et al. Apolipoprotein A5 gene promoter region -1131T/C polymorphism is associated with risk of ischemic stroke and elevated triglyceride levels: a meta-analysis[J]. Cerebrovasc Dis,2012,33(6):558-565.

[5] 全国脑血管病学术会议.各类脑血管疾病诊断要点[J].中华神经科杂志,2006,29(6):379-381.

[6] Pennacchio LA, Olivier M, Hubacek JA, et al. An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J]. Science,2001,29(40):169-173.

[7] Gonzales JC,Gordts PL,Foley EM et al. Apolipoproteins E and AV mediate lipoprotein clearance by hepatic proteoglycans[J].J Clin Invest,2013,23(6):2742-2751.

[8] Huang YJ, Lin YL, Chiang CI, et al. Functional importance of apolipoprotein A5 185G in the activation of lipoprotein lipase [J]. Clin Chim Acta, 2012, 13(1-2):246-250.

[9] Sharma V, Forte TM, Ryan RO. Influence of apolipoprotein A-V on the metabolic fate of triacylglycerol [J]. Curr Opin Lipidol,2013,24(2):153-159.

[10] Chokshi N, Blumenschein SD, Ahmad Z,et al. Genotypephenotype relationships in patients with type I hyperlipoproteinemia[J].J Clin Lipidol,2014,8(3): 287-295.

[11] Jørgensen AB, Frikke-Schmidt R, West AS,et al. Genetically elevated non-fasting triglycerides and calculated remnant cholesterol as causal risk factors for myocardial infarction[J].Eur Heart J,2013,34(24):1826-1833.

[12] Shou W, Wang Y, Xie F, et al. A functional polymorphism affecting the APOA5 gene expression is causally associated with plasma triglyceride levels conferring coronary atherosclerosis risk in Han Chinese Population [J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 42(11):2147-2154.

[13] Maasz A,Kisfali P,Jaromi L,et al. Apolipoprotein A5 gene IVS3+G476A allelic variant confers susceptibility for development of ischemic stroke.Circ J,2008,72(7):1065-1070.

R743.3

B

ISSN.2095-6681.2015.08.107.02

［基金课题］南宁市科学研究与技术开发计划资助项目（编号：201003044C-6）