不同提取方法大黄水提取物对幼年大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响

万慧杰，宋素英，佟继铭，杨　宵，卢 宁，张树峰△

（1.河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德　067000；2.华北理工大学中医学院）

不同提取方法大黄水提取物对幼年大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响

万慧杰1，宋素英2，佟继铭1，杨宵1，卢 宁1，张树峰1△

（1.河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德067000；2.华北理工大学中医学院）

目的：观察不同提取方法（煎煮和水浸）大黄水提取物对幼年雌性大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法：4周龄雌性SD大鼠随机分为正常对照组，大黄水浸剂0.5、1.0、2.0g/kg组和大黄水煎液0.5、1.0、2.0g/kg组，每组10只，各用药组大鼠连续灌胃给药30d。采用SP免疫组化法检测大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果：不同提取方法大黄水提物对雌性幼年大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达均有不同程度的影响。与正常对照组比较，水浸剂组和水煎液组大鼠子宫Bcl-2蛋白表达显著降低、Bax蛋白表达显著升高；并且，水煎液各剂量组大鼠子宫Bcl-2蛋白表达明显低于、Bax蛋白表达明显高于水浸剂相同剂量组，其中水煎液2.0g/kg剂量组大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达的变化最为明显。结论：大黄水提取物对幼年雌性大鼠子宫Bcl-2和Bax有一定影响，其影响程度与提取方法和剂量有关。

大黄；子宫；Bcl-2；Bax

大黄来源于掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R. Tanguticum Maxim. Ex Reg.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎，具有泻下攻积、泻火解毒、活血化瘀、利湿退黄等多种功效［1-2］。有报道称长期服用大黄对肝脏、肾脏以及生殖系统均可造成不同程度的毒性［3］。本研究拟观察不同提取方法制备的大黄水提取物对幼年雌性大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，以期为大黄的临床用药安全提供实验依据。

1　材料与方法

1.1药材与试剂大黄（批号：20090902），安国市长安中药材有限公司；兔抗Bcl-2、Bax多克隆抗体（批号：YE1116W、990197W），北京博奥森生物科技有限公司；兔免疫组化试剂盒（批号：20120813），北京四正柏生物科技有限公司。

1.2大黄水提取物的制备

1.2.1水浸剂：大黄药材粉碎后，10倍水浸泡两次，每次10h，合并浸提液、过滤，40℃减压浓缩至含生药量0.4g/ml备用。

1.2.2水煎液：大黄药材粉碎后，10倍水浸泡2h，煎煮两次，每次10min，合并煎煮液、过滤，40℃减压浓缩至含生药量0.4g/ml备用。

1.3实验动物分组及给药4周龄雌性SD大鼠70只，体重60-70g，许可证号：SCXK（京）2009-0004，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。大鼠随机分为正常对照组，大黄水浸剂0.5、1.0、2.0g/kg组，大黄水煎液0.5、1.0 2.0g/kg组，每组10只。各给药组大鼠连续给予不同的药物灌胃30d，正常对照组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃。

1.4大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的检测及半定量分析大鼠末次给药后禁食不禁水，24h后麻醉处死，取子宫，4%多聚甲醛固定24h后常规石蜡包埋，4μm厚连续切片。SP免疫组化法检测子宫Bcl-2和Bax蛋白的表达情况，一抗浓度为1：100，用PBS代替一抗作为阴性对照，以胞浆/胞核出现黄色或棕黄色颗粒为Bcl-2和Bax蛋白阳性产物。采用IPP 6.0软件测定子宫组织Bcl-2和Bax表达免疫组化染色的OD值，计算各组OD值的平均值并进行半定量分析。

1.5统计分析实验数据应用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

半定量分析结果：⑴大黄水浸剂1.0g/kg、2.0g/kg剂量组和大黄水煎液0.5、1.0、2.0g/kg剂量组大鼠子宫Bcl-2蛋白的表达水平明显低于正常对照组，Bax蛋白表达明显高于正常对照组（P＜0.05）。⑵相同提取方法不同给药剂量间比较：大黄水浸剂2.0g/kg剂量组和大黄水煎液1.0、2.0g/kg剂量组大鼠子宫Bcl-2蛋白的表达水平明显低于同方法0.5g/kg剂量组，Bax蛋白表达水平明显高于同方法0.5g/kg剂量组（P＜0.05）；其余各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。⑶相同给药剂量不同提取方法间比较：大黄水煎液各剂量组大鼠子宫Bcl-2蛋白表达水平明显低于大黄水浸剂同剂量组，Bax蛋白表达明显高于大黄水浸剂同剂量组（P＜0.05）。见附表。

3　讨论

Bcl-2和Bax是一对在细胞凋亡调控机制中起关键作用的因子。Bcl-2的作用是抑制细胞凋亡，Bax是Bcl-2的同源基因，它的表达可以拮抗Bcl-2的抗凋亡作用从而影响细胞生存，二者的比率决定着细胞的“命运”［4］。Bc1-2和Bax可以形成同二聚体Bc1-2/Bc1-2或Bax/ Bax，也可相互形成异二聚体Bc1-2/Bax，若同二聚体Bax/Bax形成增多，则会降低Bcl-2的活性，引起细胞线粒体级联反应，进而加速细胞凋亡［5-8］。

附表　不同大黄水提物对大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响（±s，n=10）

附表　不同大黄水提物对大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响（±s，n=10）

与正常对照组比较：aP＜0.05；相同提取方法不同剂量比较：与0.5g/kg比较，bP＜0.05；不同提取方法相同剂量间比较：cP＜0.05。

组别剂量（g/kg）Bcl-2Bax正常对照组--0.331±0.0410.126±0.042大黄水浸剂0.50.297±0.0140.162±0.052 1.00.237±0.051a0.219±0.043a2.00.178±0.034ab0.304±0.041ab0.50.231±0.033ac0.207±0.044ac1.00.187±0.043abc0.297±0.042abc2.00.159±0.052abc0.341±0.039abc大黄水煎液

本研究采用免疫组化法观察了幼年雌性大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的变化，结果显示：不同提取方法和不同剂量大黄水提物对雌性幼年大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达均有不同程度的影响。与正常对照组比较，水浸剂组和水煎液组大鼠子宫Bcl-2蛋白表达显著降低、Bax蛋白表达显著升高；并且，水煎液各剂量组大鼠子宫Bcl-2蛋白表达明显低于、Bax蛋白表达明显高于水浸剂相同剂量组，其中水煎液2.0g/kg剂量组大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达的变化最为明显。本研究表明，大黄水浸剂、水煎液对雌性幼年大鼠子宫均有不同程度的损害，其中大黄水煎液对幼年雌性大鼠子宫的影响程度较大，提示大黄水提取物对大鼠子宫的损害程度与提取方法和剂量有一定关系。

［1］卢宁，张树峰，佟继铭，等.大黄水提物对成年雌性大鼠子宫中Bcl-2、Bax表达的影响［J］.时珍国医国药，2014，25（7）：1605-1606.

［2］卢宁，张树峰，佟继铭，等.大黄水提物对成年大鼠子宫及卵巢的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（21）：258-261.

［3］王清秀，吴纯启，廖明阳，等.大黄及其主要成分的毒性毒理研究［J］.毒理学杂志，2007，21（4）：301-302.

［4］王卫东，陈正堂.Bcl-2/Bax比率与细胞“命运”［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2007，14（4）：393-395.

［5］Huang X，Choi JK，Park SR，et al.GM-CSF inhibits apoptosis of neural cells via regulating the expression of apoptosis related proteins［J］.Neurosci Res，2007，58（1）：50-57.

［6］许凌峰，王远成，俞炜源.Bcl-2蛋白的研究进展［J］.生物技术通讯，2005，16（4）：429-431.

［7］刘淑敏，常薇.邻苯二甲酸酯致雌性生殖系统毒性及其机制的研究进展［J］.环境与健康杂志，2013，30（4）：374-377.

［8］夏雷，张海荣.抑乳颗粒对高泌乳素血症大鼠子宫卵巢bcl-2/bax的影响［J］.中成药，2008，30（5）：657-660.

EFFECTS OF WATER EXTRACT OF RHUBARB BY DIFFERENT EXTRACTION METHODS ON BCL-2 AND BAX EXPRESSION IN YOUNG RATS UTERUS

WAN Hui-jie， SONG Su-ying， TONG Ji-ming， et al
（Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine/Institute of Chinese Materia Media，Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective： To observe the effects of water extract of Rhubarb by different extraction methods on expression of Bcl-2 and Bax protein in young female rats uterus. Methods: 4-week-old female SD rats were randomly divided intonormal control group， Rhubarb water agent 0.5， 1.0， 2.0g/kg groups and Rhubarb water decoction 0.5， 1.0， 2.0g/kg groups with 10 rats in each group. The rats in each drug group were lavaged with corresponding water extract of Rhubarb for 30 days. SP immunohistochemical stain was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax protein in uterus. Results: Water extract of Rhubarb by different extraction had different effects on Bcl-2 and Bax protein expression in young rats uterus. Compared with rats in normal control group， the Bcl-2 protein expression in uterus of rats in Rhubarb water agent groups and Rhubarb water decoction groups decreased obviously， while the Bax protein expression increased obviously. Moreover， the Bcl-2 protein expression in uterus of rats in each Rhubarb water decoction group was obviously lower than that of rats in each Rhubarb water agent group， while Bax protein expression was obviously higher. Among 3 Rhubarb water decoction groups，the changes of Bcl-2 and Bax protein expression in uterus of rats in 2.0g/kg group was the most. Conclusions: Water extract of Rhubarb has certain effects on Bcl-2 and Bax expression in young female rats uterus， which is concerned with extraction methods and dose.

Rhubarb； Uterus； Bcl-2； Bax

R284.21

A

1004-6879（2015）06-0463-03

2015-03-18）