菩人丹对糖尿病大鼠视网膜HO-1表达的作用

董志军，张铁民，付笑笑，陶相宜，王东华

（承德医学院附属医院眼科，河北承德　067000）

菩人丹对糖尿病大鼠视网膜HO-1表达的作用

董志军，张铁民△，付笑笑，陶相宜，王东华

（承德医学院附属医院眼科，河北承德067000）

目的：探讨菩人丹（PRD）对糖尿病大鼠视网膜血红素加氧酶l（HO-1）表达的影响。方法：36只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组，每组12只。糖尿病模型组、PRD治疗组大鼠均采用链脲佐菌素连续腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，模型成功建立后，PRD治疗组大鼠给予PRD（1.8g/kg/d）灌胃3个月。分别采用Western blot法和RT-PCR法检测大鼠视网膜HO-1蛋白和mRNA的表达。结果：模型组大鼠视网膜HO-1蛋白和mRNA的表达明显高于正常对照组大鼠（P＜0.01），PRD治疗组大鼠视网膜HO-1蛋白和mRNA的表达明显高于模型组大鼠（P＜0.01）。结论：PRD可通过上调HO-1的表达减轻糖尿病时视网膜氧化应激损伤，发挥对糖尿病视网膜病变的保护作用。

菩人丹；糖尿病视网膜病变；血红素加氧酶l

目前，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的发病率逐年升高，是造成视力损害的主要原因［1-2］。近年的研究表明，DR与氧化应激密切相关。血红素加氧酶l（Heme oxygenase-1，HO-1）是一种抗氧化防御酶，参与细胞的抗氧化应激损伤［3］。菩人丹（Purendan superfine powder，PRD）是由苦瓜、人参、丹参、制首乌、葛根、水蛭组成的中药复方，具有益气养阴清热、活血化瘀通络的功效。本研究通过观察PRD对糖尿病大鼠视网膜HO-1表达的影响，探讨PRD对糖尿病大鼠视网膜氧化应激损伤的保护作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物与试剂：PRD超微粉，河北以岭药业集团有限公司代加工生产；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美国Sigma公司；Trizol，美国Invitrogen公司；HO-1兔抗多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；HO-1引物，上海生工公司；蛋白定量试剂盒，北京索莱宝生物科技有限公司；RT-PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

1.1.2实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2006-0009），体质量200-250g。

1.2方法

1.2.1动物分组、模型制备与给药：36只大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组，每组12只。糖尿病模型组和PRD治疗组大鼠均采用2% STZ（25mg/ kg/d，3d）连续腹腔注射的方法建立糖尿病动物模型，以血糖≥16.7mmol/L作为成模标准。模型成功建立后，模型组大鼠不再做任何处理；PRD治疗组大鼠给予PRD（1.8g/kg/d）灌胃3个月。

1.2.2标本制备：给药结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5g/kg）大鼠，迅速取出眼球，在动物手术显微镜下冰面上钝性分离视网膜，投入液氮中保存。

1.2.3Western blot检测视网膜HO-1蛋白的表达：取液氮中保存的视网膜组织提取蛋白质，BCA蛋白试剂盒定量蛋白浓度。12% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，一抗、二抗孵育；Super ECL Plus超敏发光液显影。采用Quantity One-4.6.2软件对显影条带进行分析，以HO-1条带与β-actin条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.2.4RT-PCR检测视网膜HO-1mRNA的表达：取液氮中保存的视网膜组织提取总RNA，逆转录成cDNA。PCR反应条件：94℃，2min；94℃，30sec；50℃-65℃，30sec；72℃，1min，第二步起循环。HO-1引物序列为：F：5’CAGT CTATGCCCCACTCTAC3’R：5’AAGGCGGTCTTAGCCTC TTC3’，退火温度为59℃，30个循环，产物大小406bp；βactin引物序列为：F：5’CATCCTGCGTCTGGACCT3’，R：5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’，退火温度为58℃，29个循环，产物大小480bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄像，并用Quantity One-4.6.2软件进行定量分析，以目的条带的光密度与β-actin条带光密度的比值，作为目的基因mRNA表达的相对水平。

2　结果

2.1HO-1蛋白的表达情况在蛋白Marker的32KD、43KD水平处，分别可见HO-1蛋白条带和β-actin条带。糖尿病模型组与正常对照组比较，大鼠视网膜HO-1蛋白的表达明显升高（P＜0.01）；PRD治疗组与模型组比较，大鼠视网膜HO-1蛋白的表达明显升高（P＜0.01）。见附表。

2.2HO-1 mRNA的表达情况在DNA Marker的406bp、 480bp水平处分别可见HO-1和β-actin mRNA条带糖尿病模型组与正常对照组比较，大鼠视网膜HO-1 mRNA的表达明显升高（P＜0.01）；PRD治疗组与模型组比较，大鼠视网膜HO-1 mRNA的表达明显升高（P＜0.01）。见附表：

附表　各组大鼠视网膜HO-1的表达（±s）

附表　各组大鼠视网膜HO-1的表达（±s）

与正常对照组比较：1）P＜0.01；与糖尿病模型组比较：2）P＜0.01

组别nHO-1蛋白HO-1 mRNA正常对照组120.2348±0.01190.1965±0.0091糖尿病模型组120.5067±0.06051）0.4987±0.03061）PRD治疗组120.9396±0.03942）0.8976±0.01532）

3　讨论

HO是血红素分解的限速酶，具有三种同工酶，其中HO-1又称为热休克蛋白32，是参与组织细胞抗氧化应激损伤的一种内源性保护性因子［4］。HO-l主要分布在血细胞代谢活跃的组织器官，在眼的晶状体、视网膜、脉络膜广泛分布。研究发现，诱导HO-1的表达可以保护视网膜神经节细胞免受氧化应激的损伤，糖尿病大鼠视网膜中HO-1高表达具有抗炎、抗氧化损伤、抗细胞凋亡、抗增生等保护作用［5-6］。本研究成功建立了2型糖尿病大鼠模型发现糖尿病模型组大鼠视网膜HO-1蛋白和mRNA的表达水平较正常组升高，表明糖尿病时慢性高血糖引起了糖尿病大鼠视网膜组织缺氧并造成了氧化应激损伤，抗氧化蛋白增加，激活了抗氧化应激通路。

PRD是针对糖尿病病机关键“热、虚、瘀”的组方。本方以苦瓜（《广东新语》又称菩达）清解郁热；人参、丹参葛根益气生津、活血化瘀；制首乌补益精血，固肾益阴；水蛭祛瘀消，剔邪搜络。诸药协同，益气养阴，调畅气血，化瘀通络。现代药理研究证实，PRD具有抑制氧化应激、对抗细胞凋亡、改善微循环、促进组织修复与再生等作用［7-9］本研究发现，与糖尿病模型组比较，PRD组大鼠视网膜HO-1蛋白和mRNA的表达进一步升高，这说明PRD可以通过上调HO-1表达水平从而减轻糖尿病时视网膜组织细胞氧化应激损伤的程度，发挥对糖尿病视网膜病变的保护作用，但PRD调控HO-1表达的机制尚需进一步研究。由于PRD避免了化学合成药物带给人体的不良反应，因此可能为DR的治疗提供新方法。

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［9］庞宗然，李晓军，吴丽芳，等.菩人丹超微粉对肥胖型T2DM大血管损伤大鼠血清sVCAM-1、TNF-α的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2008，14（2）：152-153.

EFFECTS OF PURENDAN ON EXPRESSION OF HO-1 IN RETINA OF DIABETIC RATS

DONG Zhi-jun， ZHANG Tie-min， FU Xiao-xiao， et al
（Department of Ophthalmology， the Affiliated Hospital of Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective: To investigate the effects of Purendan （PRD） on heme oxygenase-1 （HO-1） expression in retina of diabetic rats. Methods: 36 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups （n=12）： normal control group，diabetes model group，PRD treatment group. The diabetes model rats were made by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin. After the diabetes animal model was successfully established， the rats in PRD treatment group were lavaged with PRD （1.8g/kg/d）for 3 months. Western blot and RT-PCR were respectively used to detect the expression of HO-1 protein and mRNA in retina of rats. Results: The expression of HO-1 protein and mRNA in retina of rats in diabetes model group were obviously higher than normal control rats （P＜0.01）. Compared with diabetes model rats， the expression of HO-1 protein and mRNA in retina of rats in PRD treatment group increased signifi cantly （P＜0.01）. Conclusions: PRD can reduce oxidative stress injury in retina by up-regulating HO-1 expression in retina， thus has protective effects on diabetic retinopathy.

Purendan； Diabetic retinopathy； Heme oxygenase-1

R774.1

A

1004-6879（2015）06-0472-03

2015-03-10）

（基础医学栏目编辑：陈志宏）