嘧肽·吗啉胍对烟草PVYN的抑制作用及对寄主防御酶活性的影响

周建全 张忠光 苏燕妮 董雪

摘要：为了明确嘧肽·吗啉胍对马铃薯Y病毒坏死株系（Potato virus Y necrosis strain，PVYN）的抑制作用及诱导寄主的抗性反应，采用紫外分光光度计和ELISA法研究了嘧肽·吗啉胍对烟草中PVYN浓度的影响。结果表明，嘧肽·吗啉胍可明显降低感病植物体内PVYN的浓度，抑制率达32.71%～68.73%。并检测不同处理下烟草体内过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）及超氧化物歧化酶（SOD）的变化，嘧肽·吗啉胍能诱导烟草体内PPO、POD、PAL及SOD的活性提高，说明该药剂可诱导植株产生抗病性。

关键词：嘧肽·吗啉胍；PVYN；抑制作用；防御酶

中图分类号：S432.4+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5306-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.025

Inhibition of Cytosinpeptidemycin Moroxydine Hydrochloride（CyMH） against PVYN and Effect on Activities of Protective Enzymes in Tobacco

ZHOU Jian-quan1，ZHANG Zhong-guang1，SU Yan-ni2，DONG Xue2

（1.Liaoning Province Tobacco Cooperation of Fuxin， Fuxin 123000， Liaoning， China；

2. College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract： The systemic resistance and inhibition of CyMH against Potato virus Y necrosis strain（PVYN） was determined. The influence of CyMH on the concentration of PVYN in plant were tested by UV absorption and ELISA.The results indicated that the concentration of PVYN were decreased after treated by CyMH， the inhibition rate was 32.71%～68.73%.Activities of POD， PAL， PPO， SOD in tobacco were detected under different treatments（treated with water，PVYN，CyMH）.The results showed that the tobacco treated with CyMH can induce defensive enzymes activity of tobacco（PPO，POD，PAL and SOD），and CyMH could induced resistance on the host.

Key words：CyMH；PVYN；inhibition；protective enzymes

马铃薯Y病毒脉坏死株系是影响农业生产的重要植物病毒之一。每年由于感染该病毒导致减产所造成的损失相当严重。PVYN在中国的发生和危害有急剧上升的趋势，已成为中国的主要病毒种类[1-3]。因此，为了保证农作物质量及产量，有效的防治PVYN是目前急需解决的问题之一。目前抗病毒药剂主要通过抑制病毒的增殖、转运及症状的表达来抑制病毒的复制和运输，药剂抑制以上任一过程都可减轻植物病毒的危害。还发现一些通过诱导植物抵抗病毒来抑制病毒增殖的药剂，这已成为目前研究抗植物病毒药剂的热点。PAL、POD、PPO和SOD是4种极为重要的防御酶，与植物的抗病性关系密切[4-8]。检测防御酶对病毒侵染的反应是室内鉴定植物抗病性的重要途径，可以将防御酶活性的检测作为烟草抗病性鉴定的一个辅助手段。王小青等[9]采用温度转换和人工接种试验研究了接种TMV的烟草经高温胁迫后防御酶活性的变化，证明了PAL、POD、PPO活性的变化可能与高温诱发烟草对TMV的抗性有关。顾晶晶等[10]对硫酸镁对烟草感染PVYN后病情及防御酶系活性进行了检测，处理后的烟草PAL、POD、PPO酶的活性有明显的升高，参与了烟草抗病性的反应。本试验采用药剂嘧肽·吗啉胍处理普通烟K326，探讨其对PVYN病毒的抑制作用及对烟草防御酶活性的诱导作用，为深入研究烟草抗病机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种为普通烟K326，PVYN由笔者所在研究室分离提纯并繁殖保存在无虫温室中的高感品种K326上。为防止保存期病毒致病性发生变异，在使用前15 d转接到K326烟苗上复壮。

1.2 接种方法

采用常规汁液摩擦接种法接种，当普通烟长至4～5叶期时即可接种。选取长势一致的植株，喷洒400目金刚砂，蘸取接种液轻轻摩擦叶片2～3片，接种后5～10 min用自来水轻轻冲洗叶片，试验在20～30 ℃温室内进行。

1.3 植物体内病毒浓度的测定

1.3.1 处理方法 取长势一致的普通烟K326，接种病毒前24 h与接种病毒后24 h喷洒嘧肽·吗啉胍700倍稀释液、药剂与PVYN等体积混合后1 h摩擦烟叶、喷清水作为空白对照（接种PVYN）。

1.3.2 紫外分光光度计法 取5～6叶期的烟草高感品种K326，处理同“1.3.1”，以喷清水为阳性对照，待阳性对照全部显症时，采取不同对照组发病烟草的上部叶片保存于装有液氮的保温瓶中，提纯PVYN病毒[11]。病毒浓度的测定采用紫外分光光度计（Nanodrop-ND-1000紫外可见分光光度计）法[12]，比较PVYN病毒在260 nm及280 nm处光吸收值之比与标准病毒蛋白与核酸含量的固定比值，用A260 nm来计算PVYN病毒的浓度。

病毒浓度//mg/mL=■

E为消光系数，即在波长260 nm时，浓度为0.1%（1 mg/mL）的悬浮液，光程为1 cm时的光（光密度）吸收值。

标准PVYN的E0.1%1 cm260 nm =2.8，A260/A280=1.28。

1.3.3 ELISA法 取5～6叶期的烟草高感品种K326，处理同1.3.1，处理后每隔2 d取一次样， 采用ELISA法检测不同处理下PVYN的浓度变化。取PVYN的一抗4 ℃包被过夜，洗板后加入样品，室温下孵育2 h。洗板后加入PVYN的二抗，室温下孵育2 h。以PNP溶液为底物，在405 nm下测OD值，并根据标准曲线计算病毒浓度。

1.4 烟草主要防御酶系活性的测定

1.4.1 烟草的处理 选取长势一致的烟草K326进行如下处理：①烟草喷清水作对照；②烟草接种PVYN病毒；③烟草喷嘧肽·吗啉胍。每个处理重复3次，于处理后的1、3、5、7、9、11、13 d取样，于-20 ℃保存。

1.4.2 酶液的粗提 参照逢丽丽等[13]的方法，取1 g样品置于装有液氮的研钵中快速研磨成粉末，加入1.5 mL硼酸缓冲液（0.2 mol/L pH 8.8的硼酸缓冲液含1×10-3 moL/L EDTA、5 mmol/L二硫苏糖醇）继续研磨成匀浆，收集匀浆液，再取1.5 mL上述缓冲液加入到研钵中冲洗残余，将得到的液体转移至同一离心管中，10 000 r/min、4 ℃离心25 min，上清液即为酶粗提液，-20 ℃保存待用。

1.4.3 酶活性测定 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性参照Koukol等[14]的方法测定，多酚氧化酶（PPO）参考薛应龙[15]的方法测定；过氧化物酶（POD）参考朱广廉[16]的方法测定，SOD参考朱春玉[17]的方法测定。以上每个样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 药剂处理后植株体内病毒浓度的变化

2.1.1 分光光度法测定结果 采用分光光度法测定药剂处理后的病毒浓度，结果（表1）表明，嘧肽·吗啉胍可以有效地减轻PVYN感染烟草后的发病症状，同时使植株体内的PVYN的浓度降低。接种病毒前24 h喷洒嘧肽·吗啉胍，抑制率为54.90%；接种病毒后24 h喷洒嘧肽·吗啉胍药剂，抑制率为32.71%；药剂与病毒混合后1 h再接种，抑制率高达68.73%，效果最好。本试验结果证实了嘧肽·吗啉胍能降低植株体内的病毒浓度，对病毒的复制和增殖有一定的抑制作用，从而控制PVYN对烟草的危害。

2.1.2 间接ELISA法测定结果 ELISA法试验结果（图1）表明，嘧肽·吗啉胍可以有效的降低植株体内的病毒浓度。嘧肽·吗啉胍与PVYN等体积混合后1 h接种烟草K326，接种后2～3周，寄主植株体内的病毒浓度均低于对照组。接种前24 h和接种后24 h喷药处理的植株体内的病毒浓度，在前12 d均较低，12 d以后寄主体内病毒浓度均有一定幅度的增加，但明显低于对照组，表明该药剂在抑制病毒增殖的某一过程起到一定的作用。

2.2 喷药处理后POD活性的变化

试验结果（图2）表明，接种PVYN及喷洒嘧肽·吗啉胍的烟草体内酶活性明显高于对照。喷洒清水处理的烟草体内POD酶活性从第5天开始上升，第9天开始趋于平稳。接种PVYN后第5天POD活性达到一个小高峰，随后下降，第11天又出现一次高峰，此时POD活性达到最大，随后开始下降，但其活性仍高于清水对照。单独喷洒嘧肽·吗啉胍处理的在第9天出现酶活高峰，而且植株体内POD活性始终高于清水对照，表明嘧肽·吗啉胍可在一定程度上诱导寄主体内POD酶活性的升高。

2.3 喷药处理后PAL活性的变化

PAL作为一种关键酶，在植物苯丙烷类代谢中裂解苯丙氨酸、合成酚类化合物、木质素，与植物抗病性关系密切。试验结果（图3）表明，清水对照处理在第3天到第7天PAL活性急速升高，可能是由于浇水时对烟苗造成机械损伤，诱导PAL酶活性升高；单独接种病毒处理的第7天出现酶活高峰，可能是由于PVYN侵染所致；药剂处理后，烟草叶片中的PAL的活性于第5天达到高峰，随后呈下降趋势，第9天又出现一个小高峰，但始终高于清水及接种PVYN对照组，由此可见，嘧肽·吗啉胍可明显诱导寄主PAL活性的升高。

2.4 喷药处理后PPO活性的变化

试验结果（图4）表明，各处理的PPO活性整体均呈上升趋势；对照在第11天出现酶活高峰，但在整个测定时间里均低于其他2个处理；单独接种病毒处理的第7天出现酶活高峰，可能是由于PVYN侵染所致；单独喷药处理的第11天出现酶活高峰，且均高于其他2个处理。由此可见，嘧肽·吗啉胍可明显诱导寄主PPO活性的升高。

2.5 喷药处理后SOD活性的变化

SOD是抗氧化活性酶，主要功能是专一清除氧自由基。试验结果（图5）表明，3种处理SOD活性波动较大，但整体趋势一致。烟草在喷洒嘧肽·吗啉胍和接种病毒处理第5天之后SOD活性均高于清水对照，喷洒药剂处理组在第5天出现酶活高峰，随后有所降低，但整体高于其他处理。由此可见，嘧肽·吗啉胍可明显诱导寄主SOD活性的升高。

3 结论与讨论

3.1 药剂处理后植株体内病毒浓度的变化

本试验采用紫外分光光度法和ELISA法对喷洒嘧肽·吗啉胍后植株体内PVYN病毒浓度的变化进行检测。结果表明，喷药后植株体内病毒浓度均明显低于清水对照，2种检测方法结果趋势一致，证明嘧肽·吗啉胍对植物体内的PVYN复制和增殖具有一定的抑制作用，从而降低寄主植株体内的病毒浓度，达到防治效果。由于药剂的处理方式不同，其防效也大有不同，说明嘧肽·吗啉胍抑制病毒的作用方式是多方面的，它既可以保护寄主，防止病毒的进入，又可以对寄主起到治疗的作用，还可以在体外使病毒失去侵染能力，但是其作用方式和作用位点尚不清楚，还有待于进一步的研究。

3.2 药剂对烟草主要防御酶系的影响

嘧肽·吗啉胍不仅对PVYN有较好的抑制作用，还可以通过提高寄主植物的抗病性达到防病的目的。防御酶系酶活性的升高与植物抗病性有一定相关性。本试验测定了其对烟草植株主要防御酶系的酶活性，结果表明，嘧肽·吗啉胍可诱导PPO、POD、PAL、SOD酶活提高。

在苯丙烷类代谢过程中，PAL是关键酶，其活性水平除受光、损伤、病害、激素及其他外界条件的影响外，还受内源物质的控制。随着时间的延长，上述3个处理都产生了酶活高峰，可能是由于病毒的繁殖和侵染导致寄主细胞被破坏，从而刺激寄主植物PAL活性的提高。POD参与木质素的聚合作用并清除体内活性氧。近年来许多学者已经认识到POD活性与植物抗病性的相关性，并发现病组织中POD活性明显增强[18，19]。本研究结果表明，各处理POD活性均有不同程度的提高。POD可催化形成木质素和植保素等次生抗性物质，进而可抵抗和限制病毒粒子的侵入和扩散。PPO可催化参与酚类物质代谢，形成的咖啡酸、绿源酸等具有抗病作用，形成的预苯酸是木质素的前提。嘧肽·吗啉胍处理可诱导烟草幼苗产生较高的PPO活性，由它催化所形成的醌类物质限制了病毒粒子的繁殖和扩散。SOD是一种催化超氧化物转为过氧化物的酶，可以阻碍·O2-自由基的形成。所以SOD被认为是·O2-自由基的消除剂。SOD活性高，在一定程度上说明该植株的耐病性或抗病性高。

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