辛夷6种溶剂顺序提取物对黄瓜灰霉病菌的抑制作用

2014-12-26李凡海王桂清

农业科技与装备 2014年9期

关键词：辛夷

李凡海　王桂清

摘要：采用顺序提取法，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水6种溶剂对辛夷进行提取。结果表明：去离子水的提取率最大，为12.06%；石油醚次之，为9.63%。采用生长速率法和孢子萌发法分别测定了辛夷6种顺序提取物对黄瓜灰霉病致病菌的菌丝生长和孢子萌发的抑制效果。结果表明：辛夷6种顺序提取物对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用，且对菌丝生长的EC50基本小于1 000 mg/L，对孢子萌发的EC50均在1 300 mg/L以上，说明辛夷各溶剂提取物对菌丝生长的抑制效果均优于孢子萌发；石油醚、氯仿和去离子水提取物对菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为372.15 mg/L和1 318.92 mg/L，229.84 mg/L和1965.50 mg/L以及845.44 mg/L和4 321.80 mg/L。

关键词：辛夷；顺序提取物；灰葡萄孢菌；抑制作用

中图分类号：X 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）09-0009-04

植物是生物活性化合物的天然宝库，研究和开发植物源农药是一条研发新农药的有效途径。植物源农药具有易降解、低毒性、对环境污染小等特点，符合当今社会的发展趋势，已成为研究的热点。辛夷是我国一种传统中药，是望春玉兰花蕾的统称[1]。辛夷提取物具有抑菌活性，起抑菌作用的主要活性成分存在于其挥发油中[2-4]。以不同溶剂的辛夷提取物为材料，研究其对黄瓜灰霉病致病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）的菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，为辛夷作为植物源农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 辛夷提取物的制备

采用索氏提取法[5-6]，选取极性不同的溶剂（石油醚<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<水），按照溶剂极性由小到大的顺序，对辛夷依次进行提取。然后，将提取液旋转蒸发浓缩，得到黏稠膏状粗提物，称定质量并计算其提取率。此后，置于4 ℃冰箱保存。提取率计算公式为：

提取率（%）=×100% （1）

无菌条件下，用微量二甲基亚砜（不超过总体积2%）分别将6种不同溶剂的提取物充分溶解，再用无菌水配制成40 000 mg/L的母液。此后，采用二倍稀释法将母液配成40 000、20 000、10 000、5 000、2 500 mg/L等5个浓度梯度。

1.2 供试菌株

灰葡萄孢菌从感染灰霉病的黄瓜上分离、纯化获得，保存于聊城大学农学院植物病理学实验室。

1.3 离体生物测定

1.3.1 生长速率法采用生长速率法[7]测定辛夷的6种溶剂提取物对菌丝生长的抑制效果。培养基为含药PDA（葡萄糖-马铃薯-琼脂培养基），空白对照不加药；提取物终浓度分别为4 000、2 000、1 000、500、250 mg/L；菌饼直径为0.5 cm；十字交叉法测量菌落直径，3次重复。根据菌落直径计算菌丝生长抑制率，公式如下：

校正直径=平均直径-菌饼直径（2）

抑制率（%）=×100% （3）

1.3.2 孢子萌发法以孢子萌发法[8]（悬滴法）测定辛夷的6种溶剂提取物对病原菌孢子萌发的抑制作用。提取物终浓度分别为4 000，2 000，1 000，500，250 mg/L，3次重复，根据下列公式计算抑制率：

萌发率（%）=孢子萌发数/检查孢子总数×100% （4）

抑制率（%）=×100%（5）

1.4 数据分析方法

应用Microsoft Excel软件处理数据；采用SPSS 10.0软件建立毒力回归曲线，将抑菌的百分率转换成几率值，浓度转换成对数，进行几率值分析，分别求出辛夷的6种溶剂提取物对灰葡萄孢菌的抑制浓度（EC50）[9]；利用DPS v3.01专业版软件，采用Duncar新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 辛夷提取率

采用6种溶剂对辛夷进行顺序提取，计算各样品的提取率，结果如表1所示。

提取率的高低反映植物材料在溶剂中溶解量的多少。由表1可以看出：各种溶剂之间的提取率差别较大，其中去离子水对辛夷的提取率最高，为12.06%；石油醚的提取率次之，为9.63%；丙酮的提取率最低，为1.99%。

2.2 辛夷6种顺序提取物对黄瓜灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用

辛夷提取物对灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用分别如表2和表3所示。

由表2可以看出：辛夷的6种顺序提取物对灰葡萄孢菌的菌丝生长起抑制作用，但各溶剂提取物之间的差距较大；石油醚提取物的抑菌效果最好，其次为丙酮提取物，在4 000 mg/L浓度时，抑菌率分别为99.19%和97.40%；乙醇的提取物抑菌效果最差，在

4 000 mg/L时，抑菌率仅为76.96%。

由表3可以看出：各提取物的相关系数均大于0.900 0，相关性较高；EC50最小的是氯仿提取物，为229.84 mg/L；其次为丙酮提取物，为316.48 mg/L；去离子水的EC50较高，为845.44 mg/L；菌丝EC50最高的为乙醇提取物，为1 019.82 mg/L。相对来说，溶剂极性越小，其提取物对菌丝的抑制效果越明显。

2.3 辛夷6种顺序提取物对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制作用

辛夷提取物对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制浓度（EC50）如表4和表5所示。

由表4可以看出：辛夷的6种顺序提取物对灰葡萄孢菌孢子萌发均有抑制作用；在浓度为4 000 mg/L时，石油醚提取物抑制效果最好，孢子萌发抑制率为79.50%；丙酮提取物与水提取物的抑菌效果都较差，孢子萌发抑制率分别为47.26%和46.17%，均不到50.00%。

由表5可以看出：石油醚提取物对孢子萌发的EC50最小，为1 318.92 mg/L；其次为氯仿提取物，EC50为1 965.50 mg/L；EC50最大的是水提取物，为

4 321.80 mg/L。由此可以看出，溶剂的极性越小，其提取物对孢子萌发的抑制作用越明显。

3 结论与讨论

采用顺序提取法，用6种溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水）对辛夷进行提取。结果表明：去离子水的提取率最大，为12.06%；石油醚次之，为9.63%。

采用生长速率法测定各样品对菌丝生长的抑制作用，孢子萌发法测定各样品对孢子萌发的抑制作用。结果表明：辛夷6种溶剂的顺序提取物对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用；其中，石油醚、氯仿提取物对菌丝生长的EC50分别为372.15 mg/L和229.84 mg/L，对孢子萌发的EC50分别为

1 318.92 mg/L和1 965.50 mg/L，抑菌效果较好；水提取物对菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为845.44 mg/L和4 321.80 mg/L，抑菌效果相对较差。

综上说明，辛夷中的一些物质虽易被去离子水提取，但这些物质没有抑菌活性。辛夷的主要抑菌活性物质为脂溶性物质，易被有机溶剂提取，且溶剂极性越小，提取液对孢子萌发的抑制效果越明显；用单一溶剂提取辛夷的有效成分时，可以选择石油醚或氯仿，以及与两者极性相当或极性处于两者之间的溶剂。6种测试溶剂提取物对菌丝生长的抑制效果优于对孢子萌发的抑制效果。

目前，国内利用植物粗提物抑制病原菌的研究还有很多。如王桂清[10]通过采用生长速率法和孢子萌发法测定了辽细辛根的不同溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇）粗提取物对灰葡萄孢菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，发现细辛的不同溶剂提取物对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用，并且对孢子萌发的抑制效果要好于对菌丝生长的抑制效果；其中石油醚提取物的抑菌效果较好，其对菌丝生长的EC50分别为177.44 mg/L与159.98 mg/L，对孢子萌发的EC50分别为173.23 mg/L与125.29 mg/L。王树桐等[11]研究了丁香的甲醇提取物对番茄灰霉病菌的抑制效果，发现当提取物浓度为20 000 mg/L和

10 000 mg/L时，对菌丝的抑制率达到80%以上，当提取物浓度为10 000 mg/L时，完全抑制孢子的产生，浓度为5 000 mg/L时，对产孢的抑制率为85.40%，浓度进一步稀释的话则不再表现显著抑制作用。国内对辛夷的抑菌作用也有所研究。李红梅等[3]测试了123种中草药提取物对板蓝根根腐病菌（Fusarium solani）菌丝生长及孢子萌发的抑制作用，发现辛夷提取物0.01 g/mL浓度时对菌丝生长的抑制率为11.58%，对孢子萌发的抑制率为6.00%。王树桐等[4]研究测试了123种常见中草药提取物对香蕉镰刀菌枯萎病病原菌（F. oxysporum）的抑菌作用，发现辛夷提取物1%的浓度对菌株B1和B2的菌丝生长抑制率分别为76.56%和24.73%，对孢子萌发的抑制率分别为40.06%和61.62%。

众多的研究结果表明，利用一些植物提取物来作为植物源杀菌剂是可行的，且发展前景较为广阔。为了能够更好地利用植物源杀菌剂，研究清楚其有效成分势在必行。辛夷含有的抑菌活性物质可能不止一种，各物质之间的抑菌活性可能是相辅相成的，可进行层析分离和质谱分析，进一步测定各分离物质对灰葡萄孢菌的抑菌活性。

参考文献

[1] 杨青山，周建理.中药辛夷的生药学研究概况[J].安徽中医学院学报，2010，29（5）：78-80.

[2] 王永慧，叶方，张秀华.辛夷药理作用和临床应用研究进展[J].中国医药导报，2012，9（16）：12-14.

[3] 李红梅，曹静，张凤巧.中草药提取物对板蓝根根腐病菌抑制作用研究[J].河南农业科学，2009（6）：100-104.

[4] 王树桐，黄惠琴，方哲.中草药提取物对香蕉镰刀菌枯萎病病原菌的抑制作用[J].热带作物学报，2008，29（1）：78-82.

[5] 唐裕芳，张妙玲，陶能国，等.苍术挥发油的提取及其抑菌活性研究[J].西北植物学报，2008，28（3）：588-594.

[6] 韦芳三，李纯厚，戴明，等.索氏提取法测定海洋微藻粗脂肪含量及其优化方法的研究[J].上海海洋大学学报，2011，20（4）：619-623.

[7] 王桂清.离体条件下细辛精油对3种棉花病害致病菌的抑菌活性[J].农业科技与装备，2008，178（4）：41-44.

[8] 王桂清，张军华，张敏，等.辽细辛提取物对拟盘多毛孢菌的离体抑制作用[J].河南农业科学，2008（2）：60-63.

[9] 华南农业大学.植物化学保护[M].北京：农业出版社，1998.

[10] 王桂清.辽细辛提取物对灰葡萄孢菌的抑制效果[J].植物保护，2008，34（2）：53-57.