两种多糖对奶牛乳房灌注的刺激性试验

张 哲，李新圃，杨 峰，罗金印，李晓强，刘龙海，李宏胜

（1.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州730050；2.西藏奇正藏药股份有限公司）

两种多糖对奶牛乳房灌注的刺激性试验

张 哲1，李新圃1，杨 峰1，罗金印1，李晓强2，刘龙海1，李宏胜1

（1.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州730050；2.西藏奇正藏药股份有限公司）

研究低聚糖硫酸酯和右旋糖酐硫酸酯两种多糖对奶牛乳房灌注的刺激性，为其临床应用提供参考。将0.025 g/mL的两种多糖溶液分别给奶牛乳房灌注10～50 mL，连续3 d，每天观察奶牛体温、食欲、过敏反应、乳房性状（红、肿、热、痛等症状）、乳汁外观性状，并以LMT法对乳汁进行检测。试验结果表明：奶牛乳房连续3 d灌注2.5%的两种多糖液体10～15 mL，奶牛乳房及乳汁未出现任何不良反应，但当乳房连续灌注20～50 mL多糖溶液后，部分奶牛乳房出现红肿、产奶量下降及乳汁变性等不良反应。说明两种多糖可用于奶牛乳房灌注，但安全使用范围为每个乳区每次灌注量不应超过0.45 g。

奶牛；乳房炎；低聚糖硫酸酯；右旋糖酐硫酸酯；乳房灌注；刺激性试验

乳房炎由多种病原微生物引起，是奶牛场中最常见、防治难度大、治疗成本较高的一种疾病［1］。尽管国内外学者对乳房炎已进行了多年的研究，但它仍然是威胁世界奶牛业发展的一种多发病。使用抗生素治疗乳房炎是目前较为有效的一种方法，但抗生素的大量使用会引起细菌耐药性及药物残留等问题，已严重威胁到人类健康［2］。因此，寻找绿色、安全、高效的药物来替代抗生素，已成为国内外学者研究的焦点。

大量研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老、降血糖、免疫调节等多种药理作用［3-6］，且当多糖经化学修饰，尤其是硫酸化修饰后，其生物学活性更加广泛，抗菌和抗病毒活性会进一步增强［7-8］。此外，多糖来源广泛，对机体的毒副作用较小，因此，对多糖的研究已成为当代生物科学的热门领域［9］。低聚糖硫酸酯与右旋糖酐硫酸酯是低聚糖和右旋糖酐经硫酸酯化后的产物，前期试验已证实，2.5%的这两种多糖对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌具有良好的体外抑菌作用，且眼刺激性试验表明这两种多糖对兔眼无刺激性。为将这两种多糖用于奶牛乳房炎的治疗，笔者对其进行了奶牛乳房灌注刺激性试验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 经淘汰、但部分乳区仍有泌乳功能的荷斯坦奶牛10头，由甘肃荷斯坦奶牛繁育示范中心提供。

1.1.2 药物 低聚糖硫酸酯（DEAE）及右旋糖酐硫酸酯（DS-4000），外观为白色粉末状，由西藏奇正藏药股份有限公司生产并提供。

1.1.3 试剂 奶牛隐性乳房炎诊断液（LMT），由中国农业科学院中兽医研究所药厂生产。

1.1.4 仪器 电子天平、注射器、乳头管和体温计等。

1.2 方法

1.2.1 药液的配制 使用电子天平精确称取DEAE和DS-4000适量，用生理盐水分别配成浓度为2.5%（g/mL）的药液，分装于100 mL盐水瓶，高压灭菌后备用。

1.2.2 乳房灌注刺激性试验 给药前首先测量10头淘汰奶牛的体温，并记录给药前2 d各乳室泌乳量。体温正常、乳汁LMT检测呈阴性的奶牛方可进行刺激性试验。采用乳头管给药法：用热毛巾擦拭乳头，并挤净乳汁，用75%酒精棉球消毒乳头，然后用乳导管插入乳头管内，放出乳池中残留的余乳，尔后用无菌注射器将药液注入乳室。每种药物分别注射4头奶牛，注射剂量分别为10、15、20和50 mL，另外2头奶牛乳区分别灌注10 mL和50 mL生理盐水作为对照。每头奶牛每天注射1次，连续注射3 d。

1.2.3 乳房灌注药液后观察指标 奶牛乳房灌注后，每天观察奶牛的精神和食欲，测定体温及记录每个乳区的泌乳量；观察奶牛有无发冷、震颤及心动过速等过敏反应，乳房有无红、肿、热、痛等症状；检查乳汁有无水样、絮块、血奶等病变，并对乳汁进行LMT检测。

1.2.4 LMT检测及评价 将LMT诊断液与乳汁充分混合后，依据凝集物的有无和凝集物量的多少及性状进行判定。阴性（-）：乳汁体细胞数0～20万/mL；可疑（±）：乳汁体细胞数15万～50万/mL；弱阳性（+）：乳汁体细胞数40万～150万/mL；阳性（++）：乳汁体细胞数80万～500万/mL；强阳性（+++）：乳汁体细胞数350万以上/mL。

1.2.5 多糖对奶牛乳房刺激性评价标准 在每天给药前以及最后1次给药后1、2、4、24、48和72 h，检查并记录奶牛异常反应，参照表1进行评分，如出现相应的症状即为得1分，反之则为0分，每只奶牛总积分相加再除以奶牛数即为该受试物对奶牛乳房刺激性的最后分值（按四舍五入取整数）。并按表2的评价标准判断不同浓度的两种多糖对奶牛乳房的刺激性。

表1 奶牛乳房刺激反应评分标准

表2 奶牛乳房刺激性评价标准

2 结果

乳房灌注10～15 mL2.5%的两种多糖后，未观察到肉眼可见变化；给药剂量达到20 mL时，奶牛乳房出现轻微红肿；给药剂量为50 mL时，乳房出现红肿，产奶量下降且乳汁呈水样，LMT检测为阳性。根据表1所示评分标准，10 mL及15 mL给药组和对照组刺激反应平均分值均为0，20 mL给药组平均分值为3分，50 mL给药组平均分值为7分。对照评价标准（表2）可知，10 mL和15 mL 2.5%的两种多糖对奶牛乳房无刺激性，20 mL多糖有轻度刺激性，50 mL多糖有中度刺激性。

3 讨论与结论

目前，对于药物注射安全性评价多参照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》（国食药监注［2005］106号），采用家兔进行肌内注射，取注射部位肌肉进行病理学观察，并按照给定的标准进行评价［10］。但家兔肌肉与奶牛乳房组织存在很大区别，对药物刺激性的反应也会不同。乳房灌注是通过乳导管直接将药液注射到患病乳区内，使药物直接作用于乳区内的病原菌或病变部位，具有局部药物浓度高、快速、高效、简单易行等优点，是目前国内外治疗奶牛乳房炎时最常用的局部给药方式［11］。

林涛等［12］为检测盐酸吡利霉素的刺激性，对奶牛乳房分别灌注50～250 mg的盐酸吡利霉素，在给药前一天和给药后的第2、4、8天，采集血液样品进行生化分析，采集奶样进行乳成分分析，并观察、记录各组牛的精神、食欲、呼吸、排泄等情况。结果表明，用药前后，供试奶牛血常规、血清生化指标均在正常范围内，产奶量和乳成分正常，表明盐酸毗利霉素乳区灌注不影响奶牛的正常生理功能。为研究中药复方灌注剂对奶牛乳房的刺激性，孟庆娟［13］选取泌乳期健康山羊，乳房灌注10 mL供试药液，以生理盐水为对照，连续灌注5 d，每天按时观察乳房的变化情况，有无红、肿、热、痛或激痒的反应，同时测量其体温，待药液完全吸收后，将羊宰杀，取其乳腺做组织切片观察。

以上两种评价方法虽然都能反映出受试药物对乳房的刺激性，但林涛等［12］的方法需多次采集血样及奶样，并通过血液生化仪和乳成分分析仪进行分析，操作繁琐且需要特殊的试验仪器，不易推广；孟庆娟［13］采用奶山羊代替了奶牛，但成本仍然很高，且羊与奶牛乳房对药物的刺激性反应会有不同。参照以上两种方法，结合实验室多年对奶牛乳房炎临床治疗经验，笔者等对奶牛乳房分别灌注10～50 mL的两种多糖，并以生理盐水作为对照，通过对奶牛乳汁、乳房及全身的一些症状观察，并参照自拟的评价标准，同时结合LMT试验结果，判断两种多糖对奶牛乳房的刺激性。结果表明，奶牛乳房分别灌注2.5%的DEAE和DS-4000至20 mL时，乳房出现轻微红肿；给药剂量达50 mL时，乳房严重红肿，产奶量下降且乳汁成水样，LMT检测为阳性。乳房出现红肿可能是因为这两种多糖能改善乳房组织微循环，使组织轻微充血。右旋糖酐在机体内水解后会转变成较低分子量的化合物，与血浆具有相同的胶体特性，可作为血浆代用品。小分子及低分子右旋糖酐能改善微循环，具有消除血管内红细胞聚集、防止血栓形成及渗透利尿的作用。右旋糖酐硫酸酯具有抗凝血活性［14］，并且对外周血中造血干细胞有动员作用。由于药物的刺激使得机体释放组胺，局部的小静脉和毛细血管扩张及通透性增加［15］，造成局部组织的红肿，血浆渗透压的降低，导致组织液外流而引起乳汁成水样。乳汁的分泌由一系列复杂的生理过程组成，受多种激素的调控［16］，产奶量的减少可能是由于药物刺激引起的机体激素分泌紊乱造成的。LMT试验是根据乳汁中细胞在表面活性剂和碱性药物作用下，脂类物质乳化，细胞被破坏，细胞蛋白随之形成灰白或灰黄色粘性沉淀或灰紫色胶状物质团块。健康乳室的乳汁一般因细胞数少（不超过20万/mL乳汁），故无凝集物沉淀或仅有微量沉淀。当给药剂量达到50 mL时，乳汁LMT试验为阳性，说明乳汁中存在大量的细胞。这可能是由于毛细血管通透性增加，使得细胞流入乳汁中。但出现乳房红肿、产奶量下降且乳汁呈水样及LMT阳性的原因是否如上所述，还需进一步的试验探究。

综上所述，低聚糖硫酸酯与右旋糖酐硫酸酯对奶牛乳房有一定的刺激性，两种多糖可用于奶牛乳房灌注，但其安全使用剂量为每个乳区不超过0.45 g。本试验制定的奶牛乳房灌注药物刺激性评价标准，指标可观完善，方法操作简便，不需要特殊试验仪器，能够真实反映药物对奶牛乳房的刺激性，具有一定的应用价值。

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Stimulation of Perfusion of Two Kinds of Polysaccharides on Breast in Dairy Cow

ZhangZhe，Li Xinpu，Li Hongsheng，et al
（KeyLaboratoryofNewAnimal DrugProject ofGansu Province,KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceutical Discovery,Ministry ofAgriculture,Lanzhou Institute ofAnimal Husbandryand Pharmaceutical Sciences,Chinese AcademyofAgricultural Sciences, Lanzhou 730050,China）

The stimulation test ofthe oligosaccharide sulfate and dextran sulfate in breast perfusion in dairycowwere done in order to provide a foundation for further clinical application of the two polysaccharides.10～50 mL of two polysaccharide solutions of 0.025g/mLwere perfused intobreast for three days.And then the temperature,appetite,allergic reaction,breast reaction,milk and the result of LMT were observed,respectively.The results showed that it’s safe to perfuse 10～15 mL of the polysaccharide solutions of 0.025 g/mL.But when the volume of solution reached to 20～50 mL，some breasts appeared inflamation,milk yield decrease,milk denaturation and other adverse reactions.That is to say,the polysaccharides can be used for breast perfusion,but no more than 0.45gper udder everytime.

dairycow；mastitis;oligosaccharide sulfate;dextran sulfate;breast perfusion;stimulation test

S823.5

A

2095-3887（2015）06-0038-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.012

2015-08-28

“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD12B03）；甘肃省科技支撑计划（144NKCA240）；甘肃省农业科技创新项目（GNCX-2013-59）；中国农业科学院创新工程项目（奶牛疾病研究团队）

张哲（1990-），男，硕士研究生。

李宏胜（1964-），男，研究员，博士。研究方向：奶牛乳房炎免疫及预防。