Espin为Usher综合征II型候选致病基因

韦 博，郝继龙，吴新民，王 乐＊

（1.吉林大学中日联谊医院 神经外科，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院 眼科，吉林 长春130021）

Usher综合征是一种以渐进性的视力下降和听力损失或耳聋为主的一种综合征[1－3]。视力丧失表现为视网膜色素变性，视网膜感光细胞受损后视力下降，听力主要表现先天性不同程度的听力丧失。众所周知，whirlin，espin，vlgr－1这3个蛋白在视网膜感光细胞的连接纤毛和内耳耳蜗毛细胞里组成USH2蛋白复合体，其中任何一个蛋白的缺失都会导致USH2疾病的发生，但这3个蛋白并不能完全解释该疾病的发生，所以我们相信还有更多未知的蛋白参与USH2蛋白复合体的组成，这些蛋白极有可能是组成USH2蛋白复合体的重要蛋白，而编码这些蛋白的基因也是USH2候选基因之一[4－6]。我们用酵母双杂交发现espin是USH2蛋白复合体的一个新成员，为研究USH2复合体的生物功能及由于这个复合体的缺陷导致Usher综合征II型的机制提供了崭新的研究途径。

1 资料与方法

1.1 仪器和试剂

共聚焦显微镜（model FV1000，Olympus，Tokyo，Japan）。源于兔的多克隆espin抗体（K－14）购于Santa Cruz生物技术公司。源于兔的多克隆GFP抗体购买于Abcam。链霉素和所有二抗都购买于Invitrogen公司（Carlsbad，CA）。

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 引物设计和PCR扩增 从小鼠视网膜克隆出来的whirlin全长cDNA（NP＿082916）。根据生物信息学预测结果设计一对特异性引物（Invitrogen公司合成），以鼠来源的基因组为模板进行PCR扩增，反应条件为95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s，循环30次。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶检测。

1.2.2 荧光素酶载体的构建 扩建得到的998bp产物凝胶电泳纯化回收后，用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切，再用PCR产物纯化试剂盒纯化。分别酶切纯化的扩增片段和质粒片段用T4DNA连接酶连接后转化感受态E.coli DH5α细胞，先菌液PCR初步筛选阳性克隆，再通过双酶切和测序验证，即得到含有whirlin的cherry的重组质粒。同理操作含有 whirlin的pEGFP－C2，pDsRed2－C1质粒；pcDNA3.1（－）质粒。上述DNA重组质粒均已经过DNA测序证实正确。

1.2.3 细胞培养 COS－7细胞和HEK293细胞都用含有5%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养液培养。当细胞覆盖率达到60%左右，参照TurboFectTM体外转染试剂说明书对细胞实行瞬间转染，12h后观察其荧光蛋白的表达，并进行一次更换细胞培养液。再孵育6h。待荧光表达充分后置于共聚焦显微镜下观察并照像。

1.2.4 免疫共沉淀 将转染成功的HEK293细胞，用细胞裂解液裂解细胞后并用超声波间断超声裂解，离心转数18 000g，10mim，将上清液中加入蛋白G，充分摇匀1h，离心后向上清液中加入一抗摇匀3h，离心转数18 000g 8min。于上清液中加入蛋白G，摇匀1h。，用裂解液洗沉淀物3次，再煮沸10min。所有实验步骤均在4。C条件下进行操作。最后将实验产物进行western－blot。PVDF膜用含有8%脱脂牛奶孵育1.5h，加入相应的一抗抗体于4℃过夜孵育，洗涤5min，共3次，再加入相应的二抗孵育1h，最后进行显色，观察所需的蛋白条带。

1.2.5 共定位分析 于倒置显微镜下观察转染成功并可见荧光蛋白表达的COS－7细胞，用4%福尔马林在－20℃条件下固定细胞5min，洗涤后用5%山羊血清（Goat Serum，GS）／PBS孵育2h，一抗4℃孵育24h，洗涤后用相应的二抗孵育1h，Hoechst dye 33342／5%GS／PBS孵育3min，覆盖盖玻片后于激光扫描共聚焦显微镜下观察、照像保存染色结果。

2 结果

2.1 免疫共沉淀证明 Whirlin与Espin相互作用

证实whirlin与espin相互作用，我们用whirlin质粒和用带GFP荧光的espin质粒转染HEK293细胞，进行免疫共沉淀实验 （图1），结果发现来源于兔的whirlin抗体能够沉淀下用GFP标记的espin蛋白，说明这两个蛋白存在相互作用 （图1）。

图1 Whirlin与espin相互作用

2.2 细胞共转染证明whirlin与espin在细胞质中共定位

在whirlin单独转染的细胞中，没有标记的whirlin表现出弥漫的信号模式。在whirlin和espin双转染的细胞，我们进行染色并仔细观察，我们发现这两个蛋白在细胞质中部分共定位。whirlin和espin的部分共定位同样表明whirlin和espin很有可能存在相互作用（图2）。

3 讨论

最新研究发现，在野生鼠中，肌动蛋白和静纤毛偶联蛋白对静纤毛发育都尤为重要。Espin是一种偶联肌动蛋白（actin）微丝，并促进肌动蛋白肌束的形成，主要通过阻止一端肌动蛋白肌束拆卸的同时，在另一端和促进肌动蛋白微丝聚合，从而使肌动蛋白束不断延长或者稳定。Espin蛋白主要在内耳和睾丸中表达，内耳的静纤毛主要负责将声波转化为肌电反应，是由许多紧密连接、排列均匀一致的极性肌动蛋白微丝构成[7－9]。通过对whirlin与espin的相互作用研究，我们发现在体外whirlin与espin部分共定位，两蛋白之间存在直接的相互作用。这对于研究USH综合征II型的发病机制提供了新的线索和方向。但至于这两个蛋白在什么情况下结合，在怎样的条件下还有待于我们进一步研究和探讨。

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