Espin多个结构域与whirlin在体外细胞中荧光蛋白表达共定位

王 乐，隋 源，王 颜，韦 博，郝继龙

（1.吉林大学第一医院 眼科，吉林 长春130021；2.吉林大学生命科学学院，吉林 长春130012；3.长春市中心医院 肾病科，吉林 长春130051；4.吉林大学中日联谊医院 神经外科，吉林 长春130033）

Usher综合征是一种常见的累及眼和耳疾病的综合征[1－3]。1858年，第一次描述这个疾病的特征是由一位德国眼科医生Albrecht von Grafe开始的，之后便以他的名字命名[4]。1914年，一位英国眼科医生，在69例遗传疾病的基础上再次报道这种疾病[5]。该病视力受损首先表现夜盲，进而周边视野逐渐缩小，最终形成管状视野。听力受损也是渐进性听力丧失，最终耳聋。依据他们的严重程度和发病时间，Usher综合征主要分为3种类型，Usher综合征I型，Usher综合征II型，Usher综合征III型[6，7]。以往研究证明espin全长和whirlin全长相互作用，espin是USH2蛋白复合体里的新成员。但espin的哪个结构域和whirlin存在相互作用还不是很清楚。这对于我们进一步研究USH综合征的发病机制起到非常重要的作用。

1 资料与方法

1.1 仪器

PCR仪、电泳仪、电泳槽、倒置显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜（FV1000，奥林巴斯，东京，日本）。

1.2 实验方法及步骤

图1 espin结构域示意图

1.2.1 如图1所示，espin由espin＿A，espin＿P，espin＿WH和espin＿M 4个结构域组成，用PCR得到目的基因（片段大小依次为1 050bp、950bp、665bp、488bp），限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切酶切目的基因及GFPC2载体，最终得到 GFP－espin A、GFP－espin P、GFP－espin WH、GFP－espin M质粒。以上所有质粒均经过基因测序检测验证。

1.2.2 细胞培养 于37℃恒温箱培养COS－7细胞，DMEM培养液中加入5%胎牛血清。孵育COS－7细胞24h后，用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）体外进行瞬间转染，即：将0.4μg的两种目的质粒稀释在30μl的不含胎牛血清的DMEM培养液中，取2μl Lipofectamine 2000加入30μl不含胎牛血清的培养基中，室温放置10min。最后加入相应细胞培养液中孵育10h。置于共聚焦显微镜下照像并保存图像。

2 结果

2.1 Espin由4个结构域组成

Espin由espinA、espinP、espinWH和espinM 4个结构域组成。EspinA有8个并列相连重复序列组成，espinP主要由脯氨酸组成，espinWH是类似威斯科特奥尔德里奇综合征同源蛋白结构域，espinM是促进肌动蛋白束形成。红色，蓝色，黄色和绿色的长方形分别在代表espinA、espinP、espinWH和espinM（图1）。

2.2 Espin多个结构域与whirlin在体外细胞中荧光蛋白表达共定位

分别把 gfp－espinA、gfp－espinP、gfp－espinWH 和 gfp－espinM 4个质粒和mCherry－whirlin转染入COS－7细胞中，从荧光蛋白表达来看，我们发现含有gfp－espinA、gfp－espinP和gfp－espinM这3个espin结构域的质粒的荧光蛋白表达都和whirlin全长质粒的荧光蛋白表达共定位，只有gfp－espinWH质粒的荧光蛋白表达没有和whirlin全长的荧光蛋白表达共定位 （图2）。

3 讨论

从实验结果来看，在 COS－7细胞中，gfp－espinA、gfp－espinP和gfp－espinM这3个espin结构域的质粒的荧光蛋白表达都和whirlin全长质粒的荧光蛋白表达共定位，提示这3个结构域极有可能参与蛋白之间的相互作用，我们推断espinA和espinP极有可能是调控下游espinM和肌动蛋白相互作用。但是gfp－espinWH质粒的荧光蛋白表达没有和whirlin全长的荧光蛋白表达共定位，前面提到espinM是促进肌动蛋白束形成，espin微丝和肌动蛋白束相结合一起，从实验结果来看，Gfp－espinWH质粒荧光蛋白表达是细长微丝，mCherry－whirlin质粒荧光蛋白表达是弥漫形，二者很明显没有共定位，至于espinWH结构域起到什么样的作用有待于进一步验证。

图2 Espin多个结构域与whirlin在体外细胞中荧光蛋白表达共定位

[1]Boughman JA，Vernon M，Shaver KA.Usher syndrome：definition and estimate of prevalence from two high－risk populations[J].J Chronic Dis，1983，36（8）：595.

[2]Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa[J].Lancet，2006，368（9549）：1795.

[3]Keats BJ，Corey DP.The usher syndromes[J].Am J Med Genet，1999，89（3）：158.

[4]A.von Graefe.Vereinzelte Beobachtungen and Bemerkungen.Exceptionelles Verhalten des Gesichtsfeldes bei Pigmententartung des Netzhaut.Albrecht Graefes Arch[J].Klin.Ophthalmol，1858，4，250.

[5]C.H.Usher.On the inheritance of retinitis pigmentosa，with notes of cases.R.Lond[J].Ophthalmol.Hosp.Rep，1914，19，130.

[6]Williams DS.Usher syndrome：animal models，retinal function of Usher proteins，and prospects for gene therapy[J].Vision Res.2008，48（3）：433.

[7]Yang J，Wang L，Song H，et al.Current understanding of usher syndrome type II[J].Frontiers in Bioscience in press，2012，17（1）：1165.