翼状胬肉组织CyclinD1、MMP-3和colⅢ的表达及其临床意义

赵小松 吴峥峥 钟守国 (四川省人民医院，四川 成都 610000)

翼状胬肉主要以眼局部球结膜纤维血管组织增生导致角膜组织病变为临床特征。目前，翼状胬肉发生的病理机制尚未明确，临床治疗以手术为主，但术后复发率较高〔1〕。本研究通过免疫组化方法定位翼状胬肉组织中的细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-3和Ⅲ型胶原(colⅢ)的表达程度在翼状胬肉发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集我院眼科2014年1月至2015年1月原发性翼状胬肉患者46例作为病例组，均实施鼻侧翼状胬肉切除术，其中男22例，女 24例;年龄 55～78〔平均(59.26±6.32)〕岁;病程1～39年，平均(9.24±2.01)年;其中进行期30例，静止期16例;视网膜脱离手术和斜视手术期间采集正常结膜组织39例作为对照组，其中视网膜脱离手术29例，斜视手术10例。

1.2检测方法 ①试剂与仪器:兔抗人CyclinD1抗体(1∶200)购自美国Bioworld Technology公司，鼠抗人MMP-3单克隆抗体购自上海晶美生物科技公司，鼠抗人colⅢ酶单克隆抗体购自北京莱博生物科技公司，免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。②操作步骤:翼状胬肉组织和正常结膜组织切除后即刻漂洗，清除表明血迹后即刻滴加40 g/L多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续2 μm切片，常规苏木素-伊红(HE)染色与免疫组化染色，石蜡切片放置于65℃恒温箱内烤片0.5 h，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，放置于0.01 mol/L pH 6.0枸橼酸钠缓冲液中高压高温修复3 min，自然冷却至常温，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min×3次，3%H2O2溶液中常温下孵育10 min，彻底消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗5 min×3次，5%正常山羊血清中常温下孵育0.5 h，滴加一抗，湿盒4℃低温下过夜，PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗，37℃孵育0.5 h，PBS冲洗5 min×3次，DAB显色试剂盒显色，直至出现棕黄色颗粒即可终止反应，采用自来水冲洗，HE复染，脱水透明，中性树胶封片固定，常温下自然干燥，显微镜下观察，以CyclinD1、MMP-3和colⅢ阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3免疫组化结果判定〔2〕100倍高倍镜下随机选取5个视野，每个视野计数50个细胞，以细胞质或细胞核中出现淡黄色、棕黄色和棕褐色颗粒作为阳性细胞，并根据阳性细胞数目和染色强度两方面综合评估染色结果。①阳性细胞数目:根据阳性细胞百分率计分，其中阳性细胞百分率0%评定为0分，1% ～10%为1分，11% ～50%为2分，51% ～75%为3分，76% ～100%为4分;②染色强度:其中无染色评定为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞数目积分与染色强度积分相加即为总评分，≤3分为阴性表达，＞3分为阳性表达。

1.4统计学方法 应用SPSS18.0软件进行分析，计量资料采用s表示行t检验，计数资料采用χ2检验，并采用Pearson相关性分析。

2结果

2.1HE染色结果 翼状胬肉头部组织可见明显的增生性血管形成改变，体部组织可见明显变性样改变，浅层基质见粗糙颗粒样嗜酸性物质，深层基质见胶原组织弹力样变粗糙、碎片、卷曲和断裂状纤维组织。正常结膜组织层次清晰，由排列工整的鳞状上皮细胞组成，基质由疏松结缔组织组成，胶原纤维平行排列，少量中性粒细胞和毛细血管形成。见图1。

2.2两组CyclinD1、MMP-3和colⅢ免疫组化染色比较 病例组CyclinD1、MMP-3和colⅢ免疫组化染色结果评分均明显高于对照组(P＜0.05);三者阳性表达率也明显高于对照组(P＜0.05)。见表1，表2，图2。

图1HE染色(×100)

表1 两组免疫组化染色结果评分比较(s，分)

表1 两组免疫组化染色结果评分比较(s，分)

组别 n CyclinD1 MMP-3 colⅢ46 6.45±1.21 6.12±0.95 5.98±0.75对照组 39 1.52±0.52 1.16±0.42 2.34±0.35 t/P值病例组23.64/＜0.001 30.18/＜0.001 27.83/＜0.001

表2 两组CyclinD1、MMP-3和colⅢ阳性表达率的比较〔n(%)〕

图2 免疫组化染色(×100)

2.3翼状胬肉不同分期CyclinD1、MMP-3和colⅢ阳性表达率的比较 翼状胬肉进行期CyclinD1、MMP-3和colⅢ阳性表达率明显高于翼状胬肉静止期(P＜0.05)。见表3。

表3 翼状胬肉不同分期CyclinD1、MMP-3和colⅢ阳性表达率的比较〔n(%)〕

2.4CyclinD1、MMP-3和colⅢ表达的关系 CyclinD1与MMP-3共阳性39例，共阴性4例，仅CyclinD1阳性2例，仅MMP-3阳性1例;Cyclin D1与colⅢ共阳性38例，共阴性3例，仅CyclinD1阳性3例，仅colⅢ阳性2例;CyclinD1与MMP-3、colⅢ表达呈明显的正相关(r=0.623，0.712，P＜0.05)。MMP-3与colⅢ共阳性39例，共阴性5例，仅MMP-3或colⅢ阳性各1例，MMP-3与colⅢ呈明显的正相关(r=0.706，P＜0.05)。

3讨论

翼状胬肉是局部球结膜及其纤维血管组织三角形膜样增生导致角膜组织病变的眼表疾病，其主要病理特征为上皮层和基质层成纤维细胞增生，合并新生血管形成和炎症组织浸润。大量研究表明，翼状胬肉可能通过影响正常细胞周期导致〔3〕。细胞周期主要分为分裂期和间期两阶段，而间期又分为DNA合成前期、DNA合成期和DNA合成后期，其中合成前期、合成期调控点是细胞周期最重要的调控点，在细胞周期进程中发挥决定性作用〔4〕。CyclinD1是重要的细胞周期调控蛋白，在DNA合成前期发挥正调节作用。生理状况下，CyclinD1仅在DNA合成前期呈一过性表达，如CyclinD过度表达则促进细胞从DNA合成前期向DNA合成后期转化，加快细胞周期进程，促进细胞的异常增生〔5〕。另一方面，翼状胬肉通过转化的角膜缘干细胞向角膜中央和结膜上皮侵犯，合并高血管化弹性和肥大增生和变性样改变的细胞外基质(ECM)。ECM是由细胞合成并分泌的大分子物质，参与机体发育及细胞分化、增殖、迁移等细胞生理过程，同时在炎症、肿瘤转移、浸润等病理过程中发挥重要的作用。MMP-3是锌离子依赖性蛋白水解酶，具有广泛性降解ECM，在ECM动态平衡的调节中发挥重要的作用〔6〕。同时，ECM不但对组织细胞发挥物理支持作用，而且通过细胞膜受体对细胞增殖分化、迁移、衰老、癌性病变和组织创伤修复等病理生理过程发挥控制和调节功能。胶原蛋白是构成ECM的主要结构蛋白质，一旦正常组织中的胶原纤维降解和生成平衡失调时，器官和组织将发生病变。翼状胬肉组织增生和变性样改变可能由于转化型成纤维细胞含量增多和异常导致，从而colⅢ在翼状胬肉组织中显著性高表达〔7〕。colⅢ主要位于基质层的纤维板层间，呈点状型分布，其翼状胬肉组织表达增强在一定程度上提示了胶原纤维合成明显增加，胶原纤维合成异常进一步促进翼状胬肉疾病的发生和发展〔8〕。但关于翼状胬肉组织CyclinD1、MMP-3和colⅢ的表达及其临床意义研究甚少。

静止期为翼状胬肉长期类休眠状态，不发展，胬肉厚度较薄，血管组织少，头部无浸润区，部分静止期翼状胬肉角膜无损害长达十余年;一旦接触紫外线等促发因素时，翼状胬肉发展至进行期，进展快速，胬肉充血肥厚，大量纤维血管组织增生，头部见浸润区，严重影响角膜和视神经功能〔9〕。翼状胬肉进行期和静止期交替出现，相互转化，但其促转化机制尚未明确。本研究结果揭示了通过增加CyclinD1、MMP-3和colⅢ阳性表达有助于促进翼状胬肉静止期向进行期转化，加重翼状胬肉病情严重程度，其与相关研究结果具有一致性〔10〕。而且 CyclinD1、MMP-3、colⅢ在翼状胬肉组织中显著增高，且在促进翼状胬肉静止期向进行期转化过程中发挥重要的作用〔11〕。

综上所述，通过显著上调CyclinD1、MMP-3和colⅢ阳性表达以促进翼状胬肉疾病的发生和发展，三者对翼状胬肉的诊断具有重要的意义。

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