转化生长因子-β1对巨噬细胞内胆固醇酯水解酶表达的影响

张凤香 关 宁 李晨光 罗俊生 (辽宁医学院附属第一医院心外科，辽宁 锦州 121001)

转化生长因子(TGF)-β是由许多具有相同生物学特性的信号分子共同组成的一个大家族。研究发现，TGF-β1在巨噬细胞和T细胞等多种细胞中均有表达，并参与动脉粥样硬化(AS)的形成和狭窄等过程〔1〕。胆固醇酯水解酶(CEH)是一种催化酶，它在动AS过程中起重要作用，它能催化胆固醇酯(CEs)水解为游离胆固醇(FC)，从而促进胆固醇外流，减少CEs在细胞内的蓄积，维持细胞内脂质的稳定，抑制单核巨噬细胞的泡沫化〔2〕。本实验通过Ad-TGF-β1作用于巨噬细胞，观察其是否对巨噬细胞CEH表达产生影响，进而探讨二者在AS过程中的作用。

1 材料和方法

1.1材料 THP-1人单核巨噬细胞购自中国科学院上海生物研究所细胞库;胎牛血清、胰蛋白酶购自碧云天公司;兔抗鼠CEH单克隆体、兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、PCR试剂盒、HRP标记山羊抗小鼠二抗均购自北京中杉金桥公司;小鼠CEH酶联免疫(ELISA)试剂盒购自晶美公司;人源重组腺病毒载体Ad-TGF-β1购自Gibco公司。

1.2细胞培养和分组 THP-1人单核巨噬细胞于6孔板内培养24 h，去除未贴壁细胞后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱内培养。每24～48 h传代一次。在培养的巨噬细胞加入5 ng/ml人源重组腺病毒载体Ad-TGF-β1分别刺激24、48、72 h，随后收集细胞。

1.3RT-PCR检测TGF-β1和 CEH的表达 收集并计数各组细胞，按5×106个细胞加1 ml RNAiso Plus提取细胞总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度，参照反转录试剂盒说明书进行发转录反应。反转录PCR法检测表达。CEH的上游引物为:5'-GCATCCGGATCCACCCAGAA-3'，下 游 引 物 为:5'-GAAAGAGTCAAAGATGGTGCCAGA-3'。TGF-β1 上游引物为:5'-CTGCTCACCCAACATTTCGT-3'，下游引物为:5'-GTGGTTTGTCCAAACTCATCAA-3'。内参β-actin的上游引物为:5'-ACCCTGAAGTACCCCATCG-3'，下游引物为:5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。扩增条件为:95℃ 30 s;94℃ 5 s，61℃ 30 s，共30个循环。

1.4Western印迹法检测TGF-β1和CEH的表达 收集各组细胞以冷PBS清洗2次，以裂解缓冲液提取总蛋白，蛋白浓度参照BCA试剂盒测定。煮沸变性的蛋白以每孔40 μg的含量加样，经浓缩胶为6%、分离胶为10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离。通过电转仪将凝胶上的蛋白样品移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉在37℃封闭2 h。与1∶1 000兔抗鼠CEH单克隆抗体、1∶300兔抗鼠CEH单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG(1∶200)，4℃孵育2 h。洗膜3次后用化学发光底物显影，凝胶成像。

1.5ELISA法检测CEH的分泌情况 按每孔2×105个细胞接种于24孔板中，加入处理因素，分别培养24、48、72 h。收集细胞培养上清液。从平衡至室温的密封袋中取出实验所需板条，留空白孔。加0.1 ml离心后的细胞培养上清液于反应孔中，置37℃孵育90 min。然后洗板5次。于各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1 ml，37℃孵育1 h，洗板5次。加酶结合工作液0.1 ml，37℃避光孵育30 min，洗板5次。加入0.1 ml显色底物液，37℃避光孵育15 min:于各反应孔中加入终止液0.1 ml，混匀后即可测量OD450值。

1.6统计学方法 采用SPSS13.0软件，行ANOVA分析。

2结果

2.1PT-PCR检测Ad-TGF-β1刺激的巨噬细胞CEH的表达随着Ad-TGF-β1作用时间的延长TGF-β1的mRNA表达水平明显增强(24、48、72 h分别为 25.21 ±1.04，61.96 ±1.46，99.34±2.45);同时CEH的mRNA表达水平也随之明显增强(24、48、72 h分别为 19.2 ±1.17，53.53 ±1.78，82.17 ±2.01，图1)。

图1 RT-PCR检测Ad-TGF-β1对巨噬细胞中CEH和TGF-β1 mRNA表达的影响

2.2Western印迹法检测Ad-TGF-β1刺激的巨噬细胞CEH的表达 Western印迹法检测结果发现，72 h组高于48 h组，48 h组又高于24 h组，呈现明显的时间依赖关系，即随着Ad-TGF-β1作用时间的延长TGF-β1的蛋白表达水平明显增强;同时CEH的蛋白表达水平也随之被明显增强(P＜0.05)，见图2，表1。

2.3ELISA法检测Ad-TGF-β1刺激的巨噬细胞CEH的分泌情况 Ad-TGF-β1刺激的巨噬细胞上清液中CEH的含量变化趋势与前述研究结果相似，72 h组CEH含量最高随着Ad-TGF-β1作用时间的延长巨噬细胞上清液CEH的含量明显增强(P＜0.05)。见表1。

图2 Western印迹检测Ad-TGF-β1对巨噬细胞中CEH和TGF-β1蛋白表达的影响

表1 Ad-TGF-β1 对巨噬细胞中 CEH、TGF-β1表达的影响(x ± s，n=6)

3讨论

AS是缺血性脑血管病的主要病理基础，而单核巨噬细胞是动脉粥样硬化形成的重要效应细胞。巨噬细胞可以通过吞噬血管内皮下大量脂质形成泡沫细胞构成斑块脂质核心，而当泡沫细胞发生坏死时可以释放胆固醇酯(CEs)，CEs可以在血管壁损伤处大量聚集形成了AS坏死核心，直接引起蜂窝状易碎斑块的形成〔3，4〕。

CEH是一种催化CEs水解为FC的酶，它可以在巨噬细胞中表达，减少CEs在巨噬细胞内的蓄积，从而降AS的形成。研究发现［5〕CEH的表达水平同AS的易感性呈负相关，抑制CEH的表达可以明显降低形成AS的风险。

TGF-β1在巨噬细胞内可以大量表达，它不但具有多种生物学功能，还在AS斑块的发生发展中起重要作用〔6〕。临床研究表明在AS性血管病变中，巨噬细胞内的胆固醇酯的水平和泡沫细胞的形成与单核、巨噬细胞中的TGF-β1浓度呈负相关〔7〕。上述我们得知，CEH和TGF-β1均能在巨噬细胞中表达，并通过表达的变化来影响AS的形成，但CEH和TGF-β1之间是否存在联系尚不得而知。

本实验结果发现，随着Ad-TGF-β1作用时间的延长，CEH的表达水平也随之被明显增强，呈现明显的时间依赖关系，说明可以通过增强TGF-β1的表达来提高CEH的表达。接下来又通过ELISA法检测Ad-TGF-β1刺激的巨噬细胞CEH的分泌情况，结果发现，随着Ad-TGF-β1作用时间的延长巨噬细胞上清液CEH的含量明显增强，说明可以通过提高TGF-β1的表达来影响CEH的分泌情况。

综上，本研究结果显示提高TGF-β1的表达可以增强巨噬细胞内CEH的表达，但其在AS形成过程中的作用还需进行更深一步的研究。

1 Maclellan WR，Brand T，Schneider MD.Transforming growth factor-β1 in cardiac ontogeny and adaption〔J〕.Circ Res，2000;73(2):783-91.

2 Zhao B，Fisher BJ，Stclair RW，et al.Redistribution of macrophage cholesteryl ester hydrolase from cytoplasm to lipid droplets upon lipid loading〔J〕.J Lipid Res，2005;46(4):2114-21.

3 Hansson GK，Robertson AK，Jack K，et al.Inflammation and atherosclerosis〔J〕.Annu Rev Pathol，2006;1:297-329.

4 Zhao B，Song J，Stclair RW，et al.Stable over-expression of human macrophage cholesteryl ester hydrolase results in enhanced free cholesterol efflux from human THP1 macrophages〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，2007;292(9):405-12.

5 Rothblat GH，Dela LM，Favari E，et al.Cellular cholesterol fluxstudies:method ological considerations〔J〕.Atherosclerosis，2002;163(1):1-8.

6 Oram JF，Lawn RM，Abca FE，et al.The gatekeeper for elimiating excess tissue cholesreol〔J〕.Lipid Res，2011;42(8):1173-9.

7 Erren M ，Reinecke H ，Junker R，et al.Systemic inflammatary parameters in patients with atherosclerosis of the coronary and peripheral arteris〔J〕.Artorisclor Thromb Vasc Biol，1999;19(3):2355-63.